基于双特异性代谢监测的细菌鉴定与抗生素敏感性检测平台

随着抗生素的广泛使用，耐药菌的传播已成为全球公共卫生的重大挑战。据估计，到2050年，耐药性感染可能导致的死亡人数将超过心血管疾病和癌症，成为全球主要死亡原因之一。在细菌感染的治疗中，及时准确地使用抗生素对于提高治愈率和减少耐药性至关重要。然而，目前的细菌鉴定和AST方法存在诸多局限性。传统的细菌鉴定方法主要依赖于平板计数和聚合酶链式反应（PCR）。平板计数虽然是细菌鉴定的“金标准”，但过程繁琐且耗时，通常需要5-7天。PCR虽然快速且准确，但需要大型仪器和专业人员操作，难以在资源匮乏的地区广泛应用。AST通常基于培养法，耗时2-3天，这使得临床医生在感染早期常常不得不使用广谱抗生素，进一步加剧了抗生素耐药性问题。因此，开发一种快速、准确且适用于资源有限地区的细菌鉴定和AST技术，已成为迫在眉睫的需求。

基于此背景，Chen等人设计了一种基于酶催化的生化反应的双特异性代谢监测平台。该平台利用两种核壳结构的持久性发光纳米颗粒（PLNPs）——ZGC-BHQ（靶向AzoR）和ZGM-TAMRA（靶向脂肪酶），通过检测细菌分泌的特定酶活性，并借助机器学习进行识别和分析，以此实现细菌鉴定和AST，图1。研究首先验证了这两种PLNPs的特异性、持久发光性和稳定性，并通过持久性发光信号的变化（细菌指纹图谱）实现了细菌种类的区分。实验表明，不同细菌对纳米探针的响应（发光强度）具有独特性，且PLNPs的发光强度能在1.5小时内达到平台期，显示了平台在短时间内完成细菌鉴定的能力（图2）。随后，研究引入机器学习算法对细菌指纹图谱进行分析。在这里，作者展示了5种细菌（铜绿假单胞菌P.ae、金黄色葡萄球菌S.au、肺炎克雷伯菌K.pn、表皮葡萄球菌S.ep和大肠杆菌E.co）的指纹图谱分析。结果显示（图3），不同细菌对纳米探针的响应（发光强度）具有独特性，线性判别分析（LDA）模型在细菌鉴定中表现出较高的准确性（90%），但仍有改进空间。其他非线性机器学习模型（如SVM，KNN）在后续实验中达到了100%的准确率，进一步验证了该平台的潜力。此外，平台还展示了区分细菌混合样本的能力，随机森林（RF）模型在混合样本鉴定中达到了90%的准确率（图4）。在AST方面，平台通过检测细菌在抗生素处理后的代谢变化（酶活性变化）来判断细菌的活性状态。以E.co和S.au为例，研究验证了平台在氨苄西林和万古霉素处理下的AST能力。结果显示，发光信号的变化与抗生素浓度密切相关，低于最小抑菌浓度（MIC）时发光信号较强，表明细菌处于活性状态；高于MIC时发光信号减弱或消失，表明细菌被抑制或杀死。LDA分析进一步验证了平台区分细菌活性和非活性状态的能力，预测准确率分别为90%（E.co）和100%（S.au）（图5）。

总的来说，该研究通过ZGC-BHQ和ZGM-TAMRA纳米探针检测细菌分泌的酶，并结合机器学习算法，实现了快速（5小时内）的细菌鉴定和药敏分析。与传统方法相比，该平台更高效，能够在短时间内提供可靠的诊断结果，为临床快速诊断和合理使用抗生素提供了有力支持。

图1  基于机器学习辅助的双特异性代谢监测平台的细菌鉴定和AST分析原理及流程

图2  （a）双特异性代谢监测平台的工作原理。（b-c）S.au的自荧光和持久发光光谱。ZGC-BHQ（d）和ZGM-TAMRA（e）与S.au反应前后的持久发光光谱及图像（f）。ZGC-BHQ（i）和ZGM-TAMRA（j）与E.co反应前后的持久发光光谱及图像。当OD600=1时，S.au和E.co分别与ZGC-BHQ（g、k）和ZGM-TAMRA（h、l）反应后的持续发光强度的时间依赖性响应图。

图3  （a）基于机器学习辅助的双特异性代谢监测平台用于细菌鉴定的整体流程。（b）五种细菌与ZGC-BHQ和ZGM-TAMRA孵育后的持续发光强度模式。（c）特征相关性分析。（d）基于训练集数据的LDA散点图。（e）ROC曲线分析。（f）LDA模型在验证集上的细菌鉴定结果。

图4  （a）双特异性代谢监测平台用于细菌混合样本鉴定的实验设计示意图。（b）不同混合比例的细菌样本（S.au和S.ep）在与ZGC-BHQ和ZGM-TAMRA孵育后的持久性发光强度变化。（c）RF模型中树的数量与误差率之间的关系。（d）ROC曲线分析。（e）RF模型在验证集上的细菌混合样本鉴定结果。

图5  利用万古霉素和氨苄西林处理S. au和E. co的示意图（a、d、g、j）、持久性发光强度变化热图（b、e、h、k）、LDA得分图（c、f、i、l）、LDA在验证集上的预测结果展示图（m、o）及预测准确性混淆矩阵（n、p）。

 原文链接：https://doi.org/10.1021/acssensors.4c03534