基于流式细胞术的单细胞检测

细胞死亡、细胞周期停滞和细胞衰老是癌基因激活和各种抗癌药物可能诱发三种不同的细胞反应，其中肿瘤抑制因子 TP53 可以通过转录激活所有这些反应。在一个细胞群甚至在单个细胞中，这些反应并不一定相互排斥。因此，同时测量这些反应非常重要。然而，目前的检测方法通常只能观察到一种或最多两种反应，而且往往只能检测到占主导地位的反应。

墨尔本大学的Gemma L. Kelly和Andreas Strasser教授团队于Cell Death & Differentiation上发表了研究成果，提出了一种新型流式细胞术测定法，该方法通过测量 DNA 含量和 DNA 合成以及单细胞水平的细胞衰老标志物来同时评估细胞活力和细胞周期。同时该方法可在癌细胞或未转化的人类和鼠类细胞上进行，有助于研究不同的生物过程。

研究结果

1.人类癌症衍生细胞系对 TP53 激活的反应

经Nutlin-3a（MDM2抑制剂）处理72小时后，所有野生型TP53癌细胞系的TP53蛋白水平均显著增加（2-5倍）。TP53突变的癌细胞系（如DLD-1和Sudhl-4）在处理前后TP53蛋白水平变化不大。

使用Annexin-V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡。两种野生型TP53癌细胞系（DoHH2和SJSA-1）在Nutlin-3a处理后有超过50%的细胞发生凋亡。其他野生型TP53细胞系凋亡率低于10%。

BrdU脉冲标记和7-AAD染色检测细胞周期。经Nutlin-3a处理后，所有野生型TP53癌细胞系的S期细胞比例显著下降（<5%），G0/G1期细胞比例增加，部分细胞系（如MCF-7和A549）还观察到G2/M期细胞比例增加。

使用C12FDG作为β-半乳糖苷酶（SA β-gal）的底物染色，通过流式细胞术检测细胞衰老。未发生显著凋亡的野生型TP53癌细胞系在Nutlin-3a处理后SA β-gal染色显著增加（约20-60%）。

图1 基于标准流式细胞仪的方法分析不同人类癌症衍生细胞系对 TP53 激活的反应

 2. TP53可以同时激活同一细胞系中的多个反应（（联合检测法）

 H460和RKO细胞系在Nutlin-3a处理后uPAR阳性细胞显著增加，表明细胞衰老。SJSA-1细胞系也显示出uPAR阳性细胞增加，尽管该细胞系主要以凋亡为主，这表明联合检测方法能够检测到之前单独检测中未发现的衰老细胞。

SJSA-1和DoHH2细胞系中约80%的细胞Annexin-V阳性，表明这些细胞发生凋亡。且Annexin-V阳性细胞不仅存在于sub-G1期（死亡细胞），还存在于G0/G1期。。

所有细胞系在Nutlin-3a处理后S期细胞比例显著下降，G0/G1期细胞比例增加。RKO和H460细胞系中还观察到G2/M期细胞比例的变化。uPAR阳性细胞（衰老细胞）主要存在于G0/G1和G2/M期，但不在S期。

图2基于流式细胞术的新联合方法分析不同人类癌症衍生细胞系对 TP53 激活的反应

图3 凋亡细胞和衰老细胞在细胞周期中的分布

3. 小鼠皮肤成纤维细胞（MDFs）对TP53激活的反应

Nutlin-3a诱导的衰老、凋亡依赖于TP53；依托泊苷诱导的衰老、凋亡部分独立于TP53。

Nutlin-3a处理后，细胞主要阻滞在G0/G1期；依托泊苷处理后，细胞阻滞在G2/M期，随后大量细胞进入凋亡（sub-G1期）。

凋亡细胞不仅出现在sub-G1期（死亡细胞），还存在于G0/G1期；衰老细胞主要分布在G0/G1期和G2/M期，但不在S期。

在依托泊苷处理的细胞中，观察到部分细胞同时表现出凋亡（Annexin-V阳性）和衰老（uPAR阳性）的特征。

图4 小鼠皮肤成纤维细胞（MDFs）对TP53激活的反应

 图5 小鼠皮肤成纤维细胞（MDFs）中凋亡和衰老细胞的细胞周期分布

图6 单个细胞可以同时激活多种细胞命运程序

创新点

1．开发了一种流式细胞术方法，能够在单细胞水平上同时检测细胞凋亡、细胞周期状态和细胞衰老。

2．通过联合检测方法，发现单个细胞可以同时激活多种细胞命运程序（如凋亡和衰老），且这些程序在细胞周期中具有不同的分布特征。

3．这种新的方法揭示了细胞命运的复杂性和多样性，从而为不同的生物过程提供有趣的新见解。