1. 引言

由病毒引起的传染病已成为全球公共卫生的重大问题，导致大量死亡和经济损失。已知可感染人类的病毒多达270种，其中一些新出现的病毒如中东呼吸综合征冠状病毒、猴痘病毒和埃博拉病毒等，具有高死亡率，威胁人类健康。及时准确的病毒诊断对于控制传播和指导治疗至关重要。现有的检测技术如RT-PCR和ELISA虽然成熟，但在资源匮乏地区不易实施，因此亟需开发简单、快速、灵敏的检测方法。横向流动免疫分析法（LFIA）因其快速、便携等优点而受到青睐，但现有技术在灵敏度和检测范围上存在不足。苯硼酸及其衍生物被引入LFIA系统，以提高对病毒糖蛋白的检测效率。

基于此，本研究报道了一种二维（2D）膜状磁荧光探针（GF@DQD），并在多重LFIA中展示了其优越的性能，可以支持对多种病毒的超灵敏和同时检测。首先，通过聚乙烯亚胺（PEI）介导的静电相互作用，在单层氧化石墨烯（GO）上连续吸附Fe₃O₄纳米颗粒和CdSe/ZnS量子点，成功制备了膜状GF@DQD探针。与传统球形信号纳米材料相比，GF@DQD在复杂样品中展现出更好的分散性、稳定性和更大的反应界面。其次，将4-氨基苯基硼酸（APBA）修饰到GF@DQD表面，使其能够有效捕获多个病毒糖蛋白。

图1. (a) apba修饰GF@DQD磁性荧光纳米片的合成，(b) GF@DQD-biotin标签的制备，以及(c)EBOV，MPXV和SARS-CoV-2抗原多重和超灵敏监测的LFIA生物传感器示意图。

2. 结果与讨论

柔性磁性GF@DQD-APBA探针的制备与表征

高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）图像显示，GF@DQD纳米探针表面密集覆盖小量子点，能量色散X射线能谱（EDS）验证了其层次结构；PEI修饰后，氧化石墨烯基纳米膜的zeta电位增加，而Fe₃O₄ MNPs和量子点涂层后zeta电位急剧下降，表明GF@DQD的制备依赖静电相互作用。

GF@DQD-APBA探针对多种病毒抗原通用捕获/检测能力的评价

本文测试了APBA修饰的GF@DQD探针对SARS-CoV-2、猴痘病毒和埃博拉病毒包膜蛋白的捕获和检测能力。荧光显微镜分析显示，GF@DQD-APBA能有效结合SARS-CoV-2刺突蛋白，捕获效率分别为88.1%、85.4%和89.7%。该探针在LFIA平台上表现出高特异性和灵敏度，能够同时检测多种病毒，并在阳性样本中产生强烈荧光信号，而阴性样本则未显示荧光，验证了其优越的检测性能和广谱捕获能力。

GF@DQD-APBA-Based LFIA病毒检测性能评价

本文评估了GF@DQD-APBA探针在三通道LFIA方法中对EBOV GP、MPXV A29和SARS-CoV-2 SP的捕获和检测性能，结果显示在0.01至100 ng/mL浓度范围内，荧光强度与病毒抗原浓度呈正相关，检测限分别为0.93、1.03和0.89 pg/mL。GF@DQD-APBA-LFIA的灵敏度显著高于传统ELISA和基于金纳米颗粒的LFIA，且能够在一次检测中同时筛选多种病毒，显示出在POCT领域的巨大应用潜力。

在实际示例中的应用

GF@DQD-APBA-LFIA在实际样品中的有效性和适用性得到了验证，研究显示该方法能够准确检测含有不同浓度病毒抗原的唾液样本，回收率在84.55%至107.58%之间。进一步对SARS-CoV-2感染患者的鼻咽拭子进行检测，结果显示该方法的检测准确率为100%，且灵敏度和特异性均为100%。GF@DQD-APBA-LFIA在病毒检测中展现出优越性，具有替代ELISA的潜力，并可广泛应用于其他病原体的检测。

图2. GF@DQD纳米膜的表征。

图3. APBA修饰的GF@DQD纳米片的宽扫描XPS光谱及其高分辨率光谱特征，同时分析了Fe₃O₄和CdSe/ZnS在不同纳米膜上的结合能、GF@DQD在不同pH值下的荧光强度，以及其磁滞回线和磁分离行为。

图4. 荧光显微镜分析APBA修饰的GF@DQD纳米片与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合能力及其在捕获病毒抗原方面的效率监测

图5. GF@DQD-APBA-Based LFIA病毒检测性能评价

图6. 在实际示例中的应用

3. 总结

本研究设计了一种基于APBA修饰的膜状GF@DQD探针的高灵敏度多重侧流免疫分析（LFIA）技术，能够快速、通用和定量检测新出现的病毒，包括SARS-CoV-2、MPXV和EBOV。该探针由四个部分构成：二维氧化石墨烯纳米膜、超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒、羧化量子点和APBA分子，具备强大的荧光和磁响应性能，使其在病毒捕获和检测中表现出色。GF@DQD-APBA-LFIA在20分钟内可检测到低至0.89 pg/mL的病毒抗原，灵敏度显著高于传统ELISA和基于金纳米颗粒的LFIA。通过对53份临床鼻咽拭子样本的检测，该方法显示出100%的准确率，验证了其在实际应用中的有效性。此外，该技术还能够检测其他致病性病毒，展现出广泛的应用潜力，为快速病毒检测提供了新的解决方案。

  论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c01824