电子转移驱动纳米酶：超灵敏检测大肠杆菌O157：H7的“秘密武器”

研究背景

侧流免疫层析（LFIA）由于经济实惠、灵敏、特异、用户友好、快速且稳健、无需复杂设备、可实现终端检测的优点而被广泛使用。传统的LFIA基于比色纳米粒子（如金纳米颗粒和乳胶珠），其灵敏度受限于纳米粒子的亮度不足。目前提高LFIA灵敏度的策略包括两类，一类是引入更灵敏的信号输出方式，如荧光、表面增强拉曼散射和光热信号，另一类策略是放大LFIA的比色信号，如纳米酶放大、金属原位生长和纳米材料积累。多分支纳米颗粒因其优异的光热性能和比色能力而引起关注，有望进一步提升LFIA的灵敏度。

近日，南昌大学赖卫华教授团队通过一锅法合成了多分支锰-金纳米颗粒（MnAuNPs），锰壳富含价电子，金核具有高效的电子转移能力，这种结构赋予了MnAuNPs类似氧化酶的活性，使其能够通过电子转移特异性氧化TMB。TMB的氧化产物（ox-TMB）不仅具有比色特性，还具备光热性能。此外，多分支结构使MnAuNPs本身也具有光热性能。ox-TMB与多分支MnAuNPs的协同光热效应有助于提高光热转换效率。随后，MnAuNPs被用于构建光热LFIA，用于检测重要的食源性致病菌-大肠杆菌O157: H7。

研究内容及结果

（1）MnAuNPs的合成及表征：MnAuNPs的溶液呈棕黑色，有助于在硝酸纤维素（NC）膜上产生高对比度，其紫外-可见-近红外吸收光谱显示了广泛的吸收特性。动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）图像显示，MnAuNPs具有良好的单分散性和均匀性，尺寸约为90 nm。30天内连续监测MnAuNPs的紫外-可见-近红外吸收光谱和流体动力学尺寸结果表明其具有长期稳定性。高倍率TEM图像显示MnAuNPs具有明显的核壳结构，外层为锰壳，内层为金核。高角环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）和能量色散X射线光谱（EDS）映射、EDS扫描进一步揭示了金在核中、锰在壳中的分布。然后通过X射线衍射（XRD）和高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像分析了合成的纳米粒子的晶型结构，证明了MnAuNPs中的Au的多晶结构以及外部Mn呈非晶态。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）分析进一步证实了MnAuNPs的成功合成。

（2）MnAuNPs的类氧化酶样活性研究（图1）：研究表明MnAuNPs具有类似氧化酶的活性，能够催化显色底物TMB、OPD、ABTS变色，其中TMB表现出最高的显色性能。MnAuNPs的氧化酶样活性与其浓度呈正相关，且在pH=3时表现出最高的氧化酶样活性。其催化氧化过程依赖于溶解氧（DO）的参与。实验表明，即使在去除DO（通入N₂）或添加H₂O₂的情况下，MnAuNPs仍能有效催化TMB，且反应体系在652 nm处的信号强度不变。改变N₂通入时间和H₂O₂浓度对反应体系的颜色变化无显著影响，表明MnAuNPs仅具有氧化酶样活性，且对DO干扰具有出色的耐受性。使用细胞色素c（Cyt C）作为电子受体评估MnAuNPs的电子转移能力，结果显示，MnAuNPs能够有效进行电子转移，从而表现出优异的催化活性。MnAuNPs催化TMB氧化的的过程为：TMB首先吸附在MnAuNPs表面并失去电子；随后，由于Au的高电子转移效率，Mn⁴⁺获得电子并还原为Mn³⁺，同时无色的TMB被氧化为蓝色的ox-TMB。稳态动力学分析测得MnAuNPs的Km为0.128 mM，Vmax为18.32×10^-8 M s^-1。与其他纳米酶相比，MnAuNPs表现出良好的底物亲和力和催化速率。经过35天的储存，MnAuNPs的氧化酶样活性未显著下降，表明其具有长期储存稳定性。

图1 MnAuNPs的氧化酶样活性研究。（A）TMB、MnAuNPs和MnAuNPs+TMB的紫外-可见-近红外吸收光谱及其照片；（B）最适pH值的测定；（C）TMB+H₂O₂、TMB+N₂、MnAuNPs+TMB、MnAuNPs+TMB+H₂O₂和MnAuNPs+TMB+N₂的紫外-可见-近红外吸收光谱及其照片；（D）活性物种的捕获实验；（E）Cyt C和Cyt C+MnAuNPs的紫外-可见吸收光谱；（F）MnAuNPs引发的TMB催化反应示意图；（G，H）MnAuNPs氧化酶样活性的稳态动力学曲线；（I）不同储存天数后MnAuNPs的催化活性。

（3）MnAuNPs和oxTMB的光热性能探究（图2）：不同浓度的MnAuNPs在808 nm近红外激光照射下表现出显著的光热转换能力，温度随浓度增加而升高，显示出浓度依赖性。MnAuNPs溶液在300秒后温度趋于稳定，表明其可用于即时光热信号检测，其光热转换效率为45.56%，高于已报道的其他光热材料。当MnAuNPs与ox-TMB共存时，在808 nm近红外激光照射下温度显著高于单独的MnAuNPs，证实ox-TMB显著增强了光热性能，为开发高性能光热检测平台提供了理论依据。

图2 MnAuNPs和ox-TMB的协同光热效应研究。（A）在808 nm近红外激光下，水和不同浓度MnAuNPs的光热图像；（B）在808 nm近红外激光下，水和不同浓度MnAuNPs的加热曲线；（C）在不同功率密度的808 nm近红外激光下，MnAuNPs溶液的加热曲线；（D）经过四次808 nm近红外激光的开关循环后，MnAuNPs的光热稳定性；（E）冷却期间ln(θ)-时间的线性拟合图；（F）在808 nm近红外激光下，水、TMB、MnAuNPs和MnAuNPs+TMB溶液的加热曲线；（G）在808 nm近红外激光下，不同浓度ox-TMB的加热曲线；（H）MnAuNPs和ox-TMB协同增强光热性能的示意图。

（4）级联LFIA的可行性和原理（图3）：利用MnAuNPs的氧化酶样活性和显著的光学特性（比色和光热），将抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体（mAb）偶联到MnAuNPs上，形成MnAuNPs@mAb免疫信号标签，构建了比色和光热级联LFIA。在NC膜上分别喷涂捕获抗体（pAb）和二抗（sAb），分别作为T线和C线。在目标物存在时，含目标物的样品溶液在迁移过程中使目标物与免疫信号标签及NC膜上的抗体形成双抗夹心复合物。通过催化TMB实现信号放大，使用智能手机拍照并通过ImageJ软件定量分析。随后，通过808 nm近红外激光加热LFIA条，并使用手持热像仪记录温度变化进行定量分析。

图3 级联LFIA的可行性与原理。（A）喷涂不同浓度MnAuNPs的NC膜所获得的（i）比色、（ii）催化和（iii）光热结果的照片；（B）不同浓度的MnAuNPs喷涂在NC膜上的灰度强度或ΔT值；（C）级联LFIA检测过程的示意图；（D，E）NC膜的T线和C线上代表性扫描电子显微镜（SEM）图像，分别为（D）阴性组和（E）阳性组。

（5）级联LFIA的分析性能：在优化后最佳条件下，级联LFIA用于检测大肠杆菌O157:H7，并与传统的AuNPs-LFIA进行比较。MnAuNPs-LFIA的检测限为2034 CFU/mL。经TMB催化反应后，比色信号放大，检测限降低至1048 CFU/mL。通过808 nm近红外激光照射实现光热检测，检测限进一步降低至239 CFU/mL，比AuNPs-LFIA（8892 CFU/mL）低37.21倍。进一步验证表明LFIA方法具有良好的特异性和稳定性。对牛奶、苹果汁和河水中的大肠O157：H7进行加标回收实验，回收率在82.63%-111.67%之间，变异系数在4.28%-14.19%之间，表明该LFIA具有良好的可靠性和准确性。

研究结论

本研究成功合成了具有核壳纳米结构的MnAuNPs纳米酶，其通过触发从内层金核到外层锰壳的电子转移来氧化TMB。MnAuNPs展现出更高的抗体偶联能力、卓越的氧化酶样活性以及优异的光热性能。此外，ox-TMB与MnAuNPs的协同光热效应显著增强了MnAuNPs@ox-TMB的光热性能。随后，将MnAuNPs应用于LFIA平台，用于检测大肠O157：H7能够获得比传统的AuNPs-LFIA低37.21倍的灵敏度。同时，方法具有良好的特异性和稳定性，能够在实际样品中准确可靠的检测大肠O157：H7。本研究证实了利用ox-TMB与MnAuNPs的协同光热效应显著提高LFIA灵敏度的可行性，并拓展了现场快速检测的生物传感策略。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acsnano.5c00430