5分钟双模态检测：高通量微流控平台助力耐药菌精准诊断与快速药敏分析

原创

来源：邹晶晶

2025-03-21 10:53:16

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核心提示：本文介绍了一种基于高通量微流控平台的双模态检测技术，用于快速分析病原细菌的抗生素敏感性。该微流控平台集成了三个功能单元：分离、鉴定和抗生素敏感性测试（AST），能够实现对病原细菌的快速、高通量分析。

因细菌感染而引起的疾病已成为人类生命和公共卫生安全的重大威胁，尤其是血流感染（BSI），其发病率和死亡率高，可能进一步发展为败血症或感染性休克。目前治疗细菌感染的标准方案是使用广谱抗生素进行经验性治疗，但由于临床抗生素的不当使用，导致抗生素耐药性成为治疗细菌感染的主要难题。传统病原体检测方法（如涂片显微镜检查、微生物培养、PCR和ELISA）虽然能够提供一定的诊断信息，但由于依赖细菌的自然生长周期，检测过程耗时较长，且存在试剂消耗大、操作复杂等缺点，无法满足临床对传染病早期诊断和快速药物敏感性筛选的需求。近年来，新技术（如单细胞形态学分析技术和拉曼光谱）在细菌耐药性评估方面取得了进展，但这些方法通常需要昂贵的仪器和复杂的预处理程序，限制了其在快速诊断中的应用。因此，开发一种集成化、微型化的抗生素敏感性测试（AST）平台，用于临床现场快速诊断（POC）和病原细菌的药物敏感性分析，具有重要意义。微流控技术具有样本用量少、分析速度快、灵敏度高和体积小等优点，已被应用于多个研究领域。基于微流控芯片的集成特性，构建一个集样品分离、反应和检测于一体的病原细菌AST平台成为可能。然而，由于病原细菌样本的复杂性，准确监测多个样本仍然是一个挑战。基于此研究背景，Liu等人开发了一种基于高通量微流控平台的双模态检测技术，通过结合MnO₂@ZIF-90纳米探针的多种信号报告机制（如比色和荧光），构建一个集成化的微流控平台，用于快速抗生素敏感性分析，实现复杂样本中不同病原细菌的多重检测（图1）。

简单来说，该微流控芯片集成了三个功能单元：细菌分离、鉴定和抗生素敏感性测试（AST）。实验时，将血液样本注入芯片的分离通道，利用“Y”形微柱的尺寸分离效应，过滤掉较大的血细胞，使较小的病原细菌进入后续的鉴定单元。然后，通过注入革兰氏染色试剂，对病原细菌进行固定、染色，并在芯片的圆形滑动平台上进行显微镜检查。通过观察细菌染色结果：革兰氏阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，混合样本中两种颜色均会呈现，从而鉴定感染的病原体。随后，通过多个入口将不同种类的抗生素注入高通量阵列通道，与病原细菌混合并孵育。孵育完成后，向检测单元中加入MnO₂@ZIF-90纳米探针和TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺，一种比色底物），进行比色和荧光分析。比色分析通过检测TMB在MnO₂催化下的氧化反应产生的颜色变化（通常在652 nm处有吸收峰）来评估细菌的活性。荧光分析则通过检测ZIF-90层分解产生的荧光信号（通常在430 nm处有发射峰）来评估细菌的活性。通过比色和荧光信号的变化，可以评估病原细菌对不同抗生素的敏感性。具体来说，比色信号的减弱和荧光信号的增强表明细菌活性较高，而比色信号的增强和荧光信号的减弱则表明细菌活性较低，即抗生素对细菌有抑制作用（图2）

作为例证，作者首先研究了5例脓毒症相关致病菌：野生型大肠杆菌、野生型金黄色葡萄球菌、部分耐药金黄色葡萄球菌、泛耐药鲍曼不动杆菌、泛耐药肺炎克雷伯菌肺炎亚种对不同抗生素（阿莫西林、头孢噻吩、氯霉素、卡那霉素）的药敏特性。利用智能手机捕获比色和荧光反应结果，通过RGB分析确定致病菌的最佳药物使用浓度（OAC）。结果显示，在抗生素浓度为0.15 mg/mL时，三种细菌（敏感菌）均达到最佳抑制率，而鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌则表现为耐药，这些鉴定结果与传统的抑菌圈实验结果一致（图3）。进一步，作者取江苏省中医药医院志愿者血液样本进行致病病原鉴定和抗生素药敏分析，以评估研究方法的临床应用潜力。如图4所示，临床血液样本中存在的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均能得到鉴定、药敏分析并获得敏感抗生素的OAC值。由此表明，所设计的双模态微流控芯片可用于致病菌的快速、高通量的AST分析。

总之，本研究设计了一种集细菌分离、鉴定和检测功能于一体的高通量微流控平台，能够在5分钟内完成检测，检测限低至10 CFU/mL。该平台利用MnO₂@ZIF-90纳米探针的纳米酶和荧光双重功能，通过智能手机APP进行比色和荧光双模态检测，提高了检测的灵敏度和准确性。通过比色和荧光信号的变化，能够快速评估病原细菌对不同抗生素的敏感性，显著缩短了传统方法所需的长时间孵育过程。不过，研究的验证样本数量较少，未来还需要进一步验证该平台在处理实际临床样本时的稳定性和可靠性。

图1 基于微流控平台的病原菌检测和AST的整体流程。

图2 （a）基于高通量微流控平台的病原细菌分离、鉴定和AST的示意图。（b）细菌分离过程。（c）细菌鉴定过程。（d）大肠杆菌（10⁸ CFU/mL）的AST检测过程和及其在0-10 mg/mL卡那霉素浓度下的比色和荧光显色图像。（e）反应后的芯片实际结果图。

图3 不同致病菌对不同抗生素的比色（a）和荧光（c）反应。不同抗生素浓度下不同致病菌的比色（b）和荧光（d）反应。SA：野生型金黄色葡萄球菌，DR-SA：耐药金黄色葡萄球菌，DR-ABA：耐药鲍曼不动杆菌，EC：野生型大肠杆菌，DR-KP：耐药肺炎克雷伯菌肺炎亚种。I：阿莫西林，II：头孢噻吩，III：氯霉素，IV：卡那霉素。红框表示细菌对培养的抗生素敏感，黑框表示细菌对抗生素耐药。彩色柱子表示OAC。（e）不同致病菌对不同抗生素的抑菌圈结果。（f）不同致病菌对抗生素反应的生长曲线(1：SA，2：SA+卡那霉素，3：DR-SA，4：DR-SA+卡那霉素。（g）SA和DR-SA对卡那霉素的最低抑制浓度（MIC）。