磁性富集-SERS指纹图谱：一种用于快速鉴定和药敏试验假单胞菌的新方法

1. 引言

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染可导致多种疾病，尤其在免疫功能低下者中更为严重。传统检测方法如聚合酶链反应和质谱技术存在成本高、耗时长等缺点，因此开发低成本、高灵敏度的生物传感器显得尤为重要。电化学发光（ECL）和荧光（FL）各具优势，但单模检测存在假阴性/阳性问题。结合ECL和FL的双模生物传感器能够提高检测精度。铱（III）配合物因其优异的发光性能被广泛应用于双模传感器的开发，而CRISPR/Cas12a系统则提供了高特异性和灵敏度的检测手段。结合磁性纳米颗粒的特性，能够简化样品处理步骤，进一步增强生物传感器的应用潜力。

本研究创新性地将CRISPR/Cas12a系统与铱(III)配合物相结合，设计了一种基于Ir (dmpq)₂(acac)的ECL/FL双模磁性生物传感器，用于铜绿假单胞菌的超灵敏检测。如方案1所示，该方法首先将Ir (dmpq)₂(acac)和磁性纳米颗粒包封在硅球上，合成了磁性发光单元（Fe₃O₄@SiO₂@Ir/SiO₂）。这种功能化磁性发光硅球的成功合成为功能化发光材料的简单分离提供了一种有效途径。该方案巧妙地整合了CRISPR/Cas12a系统和Ir (dmpq)₂(acac)，构建了双模生物传感器。当目标DNA被CRISPR/Cas12a系统特异性识别时，系统的切割功能被激活，信号单元上具有灭活单元的DNA被切割，从而导致信号恢复。所构建的双模磁性生物传感器对铜绿假单胞菌样品的检测具有较高的特异性和重复性，为获得高效、灵敏的铜绿假单胞菌检测方法提供了一种新的策略。

方案1. (A)信号单元的编制；(B)铜绿假单胞菌双模检测生物传感器示意图。

2. 结果与讨论

材料表征

通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对合成材料进行表征。结果显示，Fe₃O₄纳米颗粒呈球形，粒径约50 nm，表面较粗糙。涂覆后的Fe₃O₄@SiO₂微球均匀，直径约200 nm，表面光滑。磁性发光单元颗粒直径约500 nm，表面更粗糙。能谱分析（EDS）表明Fe₃O₄@SiO₂@Ir/SiO₂微球中C、N、O、Si、Fe和Ir元素均匀分布，Fe和Ir的存在率分别为1.34%和0.59%，证实了元素成功掺入。

图1. 材料表征

双模生物传感器的可行性

合成材料的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析显示，Fe-O在548 cm⁻¹处出现尖峰，Fe₃O₄@SiO₂和Fe₃O₄@SiO₂@Ir/SiO₂在1054 cm⁻¹和797 cm⁻¹处的新峰归因于Si-O-Si的拉伸振动。2969 cm⁻¹和2877 cm⁻¹处的吸收峰与C-H的拉伸振动相关，而1558 cm⁻¹的弱带则是N-H的拉伸振动峰。这些结果证实了发光微球的成功合成。紫外（UV）光谱分析表明，Fe₃O₄@SiO₂@Ir/SiO₂微球的吸收峰与Ir (dmpq)₂(acac)一致，进一步确认了铱配合物成功封装在硅球中。

图2. 双模生物传感器的可行性

双模传感器的检测性能

为了研究ECL/FL双模生物传感器对铜绿假单胞菌的灵敏度，在最佳反应条件下，孵育不同浓度的目标DNA并测量其ECL和FL信号。结果显示，ECL和FL强度随着dsDNA浓度增加而增强，并与dsDNA浓度的对数呈良好线性关系。ECL的线性方程为y = 971.66 lgx + 1305.89，最低检出限（LOD）约为73 fM；FL的线性方程为y = 0.604 lgx + 1.148，LOD为0.126 pM。这表明该双模生物传感器具有优异的分析性能。

图3. ECL/FL双模生物传感器检测铜绿假单胞菌的灵敏度

为了评估传感器的性能，研究了其选择性和稳定性。通过与不同靶标（如单碱基和双碱基错配靶标及常见细菌）进行对照实验，发现除铜绿假单胞菌外，其他物质的ECL和FL信号变化不明显，表明传感器具有良好的特异性。稳定性测试显示，信号强度在连续测量中无显著变化，且长期储存后仍保持高响应率（ECL信号93%，FL信号92%）。这些结果表明该生物传感器在检测铜绿假单胞菌方面具有显著的选择性和稳定性。

图4. 传感器的选择性和稳定性

3. 总结

本研究创新性地研发了一种新型铱基双模磁性生物传感器，该传感器结合CRISPR/Cas12a系统，能够高效且精准地识别铜绿假单胞菌。其主要优势在于：首先，磁性纳米颗粒封装的发光单元设计，简化了分离和纯化过程，无需逐步修改工作电极。其次，采用光学性能卓越的Ir(dmpq)₂(acac)作为双信号探针，为开发基于铱（III）配合物的多功能指示剂双模检测平台提供了新思路。此外，功能化磁性纳米颗粒作为信号单元，改善了传统检测方法中仪器昂贵、程序耗时、操作复杂等问题。ECL和FL双模式联用，通过不同信号转导机制进行交叉验证，显著降低了假阴性/阳性结果，提高了检测准确性。CRISPR/Cas12a系统能够特异性识别铜绿假单胞菌的双链DNA，并通过crRNA序列切割信号单元，实现精准检测。该ECL/FL双模磁性生物传感器具有高度的灵活性，只需调整crRNA序列，即可应用于其他细菌的检测，展现出巨大的应用潜力。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116678