CRISPR再突破，手机也能核酸诊断

由细菌、真菌、病毒等微生物引发的传染病对人类健康具有严重威胁，PCR技术仍是核酸检测的金标准，但在即时检测（POCT）中，传统的PCR技术劣势尽显，它需要相对来说较大的设备和较为专业的操作员，并且检出时间较长。近些年，等温扩增技术，如LAMP，RPA，RCA等备受检测人员青睐，它们不依赖与温度循环，检测时间更短，但仍存在特异性低和准确性低的缺点。在这种背景下，CRISPR-Cas技术被应用于开发快速性和特异性优势的生物分子检测工具中，其中最常见的就是CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13。胡飞博士课题组在先前基于CRISPR-Cas13a系统的无污染生物传感器的基础上，进行了优化，开发了一种便携式核酸检测仪（图1），能够在20分钟内，实现自动化核酸检测，本文将对这项研究进行解读。

图1 便携式核酸检测系统及可行性检测

基于CRISPR-Cas的核酸检测技术，通常依赖于预扩增过程来增加扩增子的数量，本文采用的预扩增手段是RPA技术。胡飞博士首先对预扩增和CRISPR反应之间的反应时间进行了优化（图1）。在优化的实验条件下，高于3000的荧光强度已经可以与阴性结果（950）完美区分，为了保证准确性，将荧光强度达到5000时作为反应的终止指令，大幅缩短了检测时间。之后又对不同的扩增时间以及CRISPR反应时间进行了组合测试，最终结果发现扩增12 min后的切割反应能够达到较好的效果，总反应时间约15分钟以内。

图2 优化RPA和CRISPR之间的反应时间

为了实现小型化、便捷化的即时检测，胡飞博士还开发了一种小型的便携式检测装置（图1 A）。主要组成包括光学检测模块、离心模块、加热模块和辅助部件，基于Studio集成开发平台，设计了一款智能手机APP，可以完成设备的调试、温度控制、数据采集、图像处理和结果输出（图1）。以真实的临床SARS-CoV-2样本为样本，检测N基因和Orf1ab基因，结果发现15分钟反应后能够准确检测阳性和阴性样品。

为了进一步缩短实验步骤，作者将样品拭子在室温下直接用2 mL核酸释放剂进行处理，省略了纯化步骤，混合物直接用于实验，结果发现样品使用20%核酸释放试剂处理时并不会影响实验结果的检出，并且还能微微加速CRISPR反应的速率（图3）。

图3 核酸释放试剂对实验检出结果的影响

最终，对设备效果进行评估，在满足便携性及灵敏度的同时，还具有高特异性，检测灵敏度与荧光定量PCR相当，达到了单分子检测的水平，对于临床检测是绰绰有余（图4）。

图4 检测设备的特异性和灵敏度

综上，胡飞博士开发了一种便携式的全自动核酸检测设备，基于CRISPR的原理，结合RPA扩增技术，通过手机APP设置反应条件及进出样，能够在15分钟内高灵敏、高特异性地检测待测病原体核酸，具有广泛地应用前景。并且，在设备的基础上，胡飞博士还测试了免纯化核酸释放对于检测的影响，结果发现影响微乎其微，这进一步提高了检测的效率，省略了检测的步骤，未来的研究中，可以探索不同检测方法的组合，开发不同探针，或可实现多病原菌的同时检测。

参考文献：Fei Hu, Yunyun Zhang, Yue Yang, Lixin Peng, Shuhui Cui, Qing Ma, Fangning Wang, Xincheng Wang. A rapid and ultrasensitive RPA-assisted CRISPR–Cas12a/Cas13a nucleic acid diagnostic platform with a smartphone-based portable device. Biosensors and Bioelectronics 280 (2025) 117428