深度学习增强的便携式无透镜全息生物传感平台：实现无扩增核酸检测的新途径

1. 引言

近年来，荧光微球免疫分析法、金纳米颗粒免疫分析法和纳米孔基飞升阵列等数字单颗粒检测方法因其高灵敏度和准确度而被广泛应用于生物传感中。CRISPR-Cas12a系统也因其特异性激活和侧切能力而在护理点检测（POCT）领域得到广泛应用。然而，这些方法通常需要复杂的操作步骤和昂贵的设备。为了解决这些问题，无透镜全息显微镜结合PS微球信号探针被提出，提供了紧凑、经济、宽视场的成像解决方案。人工智能辅助图像处理方法，如深度学习，正在被用于提高图像处理效率和准确性。这些技术使得便携式设备的开发成为可能，适用于医疗诊断、环境监测和食品安全检查。

本研究报道了一种深度学习辅助的数字单粒子计数生物传感平台，利用便携式无透镜全息（PLH）显微镜进行核酸无放大检测。该平台结合CRISPR-Cas12a系统和磁性纳米粒子（MNP）噬菌体介导的DNA提取技术，成功应用于鼠伤寒沙门氏菌的检测。噬菌体在15分钟内特异性捕获活菌，RIPA裂解缓冲液在5分钟内释放DNA。该方法区分活死菌，无需额外DNA提取步骤。PLH显微镜捕获PS微球全息图，基于YOLOv7的图像处理技术高效识别微球，转换为目标浓度。

方案1. 细菌检测用DPDPC生物传感平台示意图。(A)细菌DPDPC生物传感平台检测机制，包括噬菌体介导提取、基于crispr的生物传感、PLH成像/AI检测。(B) PLH显微镜结构。该器件主要由部分相干照明、CMOS图像传感器、微控制器和移动电源组成。(C) DPDPC生物传感平台人工智能辅助图像处理技术，包括ASP数字重建、YOLOv7网络、人工智能检测。

2. 结果与讨论

深度学习辅助图像处理方法

为了实现DPDPC生物传感平台的高速、准确检测，开发了一种基于CNN的深度学习辅助图像处理方法。该方法用于自动重建全息图并计数PS微球，适用于复杂背景噪声下的图像处理。CNN方法在识别PS微球方面表现出高准确率（97%以上），优于传统的计算机视觉方法和商业软件，如Image-J。CNN可以区分微球和其他干扰信号，并且在处理大量图像时具有显著的速度优势，仅需30秒处理200张图像。这种方法为高通量、简单、高效的图像分析提供了新途径。

图1. PLH显微镜捕获的PS微球全息图数字图像处理技术评价。

DPDPC生物传感平台的可行性与表征

DPDPC生物传感平台的可行性通过评估PLH显微镜对PS微球成像的精度和激活Cas12a切割不同目标探针的性能进行验证。PLH显微镜可以直接记录相位和振幅信息，通过算法重建图像，准确识别PS微球数量与浓度之间的线性关系（R² = 0.99）。Cas12a的反式切割活性仅在存在鼠伤寒沙门氏菌DNA时被触发，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示Cas12a可以切割ssDNA探针。SEM表征证实了PS-MNP复合物的成功偶联和DPDPC平台的可行性。噬菌体介导的DNA提取效率高，捕获效率在80%以上。

图2. DPDPC生物传感平台的可行性及表征。

鼠伤寒沙门氏菌检测的DPDPC生物传感平台

DPDPC生物传感平台用于检测鼠伤寒沙门氏菌，通过噬菌体介导的DNA提取和CRISPR-Cas12a系统实现无扩增检测。该平台利用PLH显微镜和AI辅助图像处理技术，能够准确计数PS微球，反映细菌浓度。检测结果在10² ~ 10⁷ CFU/mL范围内呈良好的线性关系（R² = 0.99），检出限为72 CFU/mL。与qPCR和ddPCR相比，DPDPC平台具有成本低、灵敏度高、便携等优点。噬菌体特异性识别活菌，避免了非活菌的干扰。该平台适用于POCT，具有广泛的应用潜力。

图3. DPDPC生物传感平台检测鼠伤寒沙门氏菌的结果。

各种实际样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测

研究人员使用DPDPC生物传感平台检测了80份来自武汉超市的鸡肉、猪肉、生菜和牛奶样品中的鼠伤寒沙门氏菌。该平台结合了CRISPR-Cas12a系统和全息成像技术，利用PS微球作为探针。结果显示，DPDPC平台成功识别出18份阳性样本，与qPCR检测结果高度吻合（R²=0.98）。虽然存在一些假阳性，但重复测量结果一致。该平台具有高特异性、灵敏度、稳定性，且成本低廉，无需DNA扩增，在食源性致病菌现场快速检测方面具有应用潜力。

图4. DPDPC生物传感平台实际样品分析结果。

3. 总结

本研究开发了一种深度学习辅助的数字单粒子计数生物传感平台，用于核酸的无放大检测。该平台整合了CRISPR-Cas12a系统和便携式无透镜全息显微镜，显著提升了两种技术的分析性能。无透镜全息显微镜具有低成本、高便携性和超宽视野等优势，使其成为理想的信号读取设备，推动了单粒子生物传感器从实验室走向现场即时检测（POCT）的应用。此外，研究人员利用训练好的卷积神经网络（CNN）模型，实现了在配备GPU的笔记本电脑上进行非实验室检测，进一步提升了平台的实用性。为了提高检测的特异性，该平台采用了mnp噬菌体引导的DNA提取技术，能够区分复杂基质中的活菌和非活菌。然而，该平台目前仍存在一些局限性。由于CRISPR-Cas12a系统的反式切割特性和CMOS传感器的光学衍射限制，平台无法同时进行多靶点检测和纳米级探针成像。此外，CRISPR-Cas12a系统的酶切效率仍有待提高，以缩短反应时间。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102238