利用铁转运在细胞和临床环境中对分枝杆菌进行超灵敏检测

图一：超灵敏检测流程示意图

铁元素是细菌生存的关键营养素，其需从宿主或环境中获取难溶且痕量的三价铁（Fe³⁺）。细菌通过分泌铁载体（siderophores）介导 Fe³⁺的摄取，目前已发现 500 余种铁载体，其中约 270 种结构已明确。结核分枝杆菌（Mtb）作为高致病性病原体，每年导致约 1060 万结核病新发病例及 130 万死亡病例。Mtb 依赖羧基分枝杆菌素（cMbT）和分枝杆菌素（MbT）从宿主巨噬细胞吞噬体内高效捕获 Fe³⁺，并通过异源二聚体 ABC 转运蛋白 IrtAB 将 Fe³⁺转运至胞内还原为可溶性二价铁（Fe²⁺）供代谢利用。IrtAB 作为 cMbT 和 MbT 的共同受体，在分枝杆菌铁摄取中发挥核心作用，且对 MbT-Fe 复合物表现出显著偏好性，这为靶向 Mtb 的探针设计提供了关键靶点。现有针对革兰氏阴性菌的铁载体 - 荧光探针（SpFCs）虽可实现病原检测，但存在探针浓度高（10–100 μM）、孵育时间长（1–12 小时）、光稳定性差等瓶颈，且尚无针对 Mtb 的特异性探针报道。传统检测方法如金胺 O 染色依赖分枝杆菌细胞壁分枝酸的靶向，但操作繁琐且灵敏度有限；近期开发的基于海藻糖的荧光探针（如 RMR-Tre）虽提升灵敏度，但仍面临代谢累积耗时（>1 小时）、探针浓度高（10–100 μM）及光稳定性不足等问题。本研究基于 MbT/cMbT 结构，开发了靶向 IrtAB 铁转运通路的分枝杆菌素 - 荧光探针（MbTFCp）N14G 及其 Fe³⁺复合物 N14G-Fe（如图一所示）。N14G 通过 IrtAB 介导的主动转运高效标记分枝杆菌：其在 5 分钟内可检测低至 1–10 nM 的耻垢分枝杆菌；10 分钟即可标记 0.1 μM 的卡介苗（BCG）及 Mtb 野生株 H37Rv，检测限达 34 CFU。如图二所示：N14G-Fe 通过胞外 Fe³⁺淬灭荧光、胞内 Fe²⁺释放恢复荧光的机制，实现高信噪比检测。临床验证显示N14G/N14G-Fe 可特异性识别结核患者痰液样本中的 Mtb，荧光信号显著，为结核病快速诊断提供了高灵敏度、高时效性的新策略。该研究首次将 IrtAB 靶向探针应用于 Mtb 检测，突破了传统方法的灵敏度与时效性限制，具有重要临床转化潜力。

探针设计巧妙结合分枝杆菌素（MbT）的结构特征与荧光团的信号放大功能：通过偶联 MbT 与罗丹明衍生物，N14G 可被 IrtAB 特异性识别并主动转运至菌体内，其检测灵敏度较传统探针提升 10 倍以上。其中，N14G 在 1 nM 浓度下仅需 5 分钟即可标记耻垢分枝杆菌，荧光增强倍数（FFC）达 19 倍；而 N14G-Fe 通过 “胞外淬灭 - 胞内激活” 的双重机制显著提升信噪比 ——Fe³⁺在胞外通过顺磁效应和电子云重排淬灭荧光，进入菌体后经 IrtAB 介导的还原反应释放 Fe²⁺并恢复探针荧光，实现检测限低至 34 CFU（H37Rv 野生株）。分子对接实验揭示探针与 IrtAB 的相互作用机制：N14G-Fe 通过 4 个氢键锚定于 IrtAB 的 SID 结构域（Q237、A238、A245 残基），而游离 N14G 则依赖 R55 和 A245 残基结合，解释了铁复合物与非复合物的转运偏好性。基因敲除实验进一步验证通路特异性：IrtAB 缺失株（ΔIrtAB）的探针摄取量下降 53%，且 DprE1 抑制剂 BTZ043 预处理可抑制 66% 的荧光信号，证明探针内化依赖活性铁转运通路。临床验证中，N14G/N14G-Fe 在结核患者痰样中特异性标记 Mtb 并呈现强荧光，突破传统染色法（如金胺 O）需固定、脱色等繁琐步骤的局限。相较硝基还原酶依赖型探针（如 Cy3-NO₂-Tre 需 1 小时孵育且 FFC<10 倍）或代谢累积型探针（如 RMR-Tre 需高浓度 10-100 μM），该策略将检测时间缩短至 1/12，灵敏度提升 20 倍，为结核病即时诊断（POCT）提供了革命性工具。未来研究可进一步优化探针的 Fe²⁺抗淬灭性能，并探索非铁依赖的 MbT 转运途径（如 N14G-Bz 实验提示的细胞壁新靶点），以拓展其在耐药菌检测及活菌代谢监测中的应用。

图二：N14G-Fe 的荧光和生物测试（A） N14G-Fe 中荧光开关的潜在机制。（B） N14G （0.5 μM） 和 N14G-Fe （0.5 μM） 在 ddH 2 O 中的发射光谱 （C） 与 N14G （0.01 μM） 和 N14G-Fe （0.01 μM） 孵育 1 小时的耻垢分枝杆菌的流式细胞术分析 （D） 用 N14G-Fe （0.01 μM） 标记 1 小时的活耻垢分枝杆菌的共聚焦图像。比例尺，5 μm。（E） 流式细胞术分析

为了验证荧光探针 N14G 及 N14G-Fe 在临床痰样本中的高效检测能力，如图三实验采用 0.1 μM 探针孵育 10 分钟的策略，成功标记牛分枝杆菌 BCG 和实验室 H37Rv 标准株，其中 N14G 对 H37Rv 的检测限（LOD）低至 34 CFU，较传统硝基还原酶探针 Cy3-NO₂-Tre（LOD=430 CFU）灵敏度提升 12.6 倍（图 S31）。在 11 例结核患者痰样本中，经 NALC/NaOH 去污染处理后，N14G 和 N14G-Fe 均特异性标记 Mtb 并呈现显著红色荧光，而健康捐赠者痰样本无信号（图 6C、S33-S40）。值得注意的是，N14G-Fe 通过 “Fe³⁺开关” 机制实现胞外荧光淬灭与胞内激活，其信号强度与游离型 N14G 相当，证实其临床适用性。对照实验显示，金胺 O（AO）染色与探针检测结果一致，但后者避免了传统染色法的复杂脱色步骤。研究进一步发现，分枝杆菌分泌的天然分枝杆菌素或人工合成的 MbT 类似物均可作为高特异性诊断工具，提示该策略对临床菌株的普适性。这些数据表明，基于 IrtAB 铁转运通路的探针技术能以超低检测限（34 CFU）、短时程（10 分钟）实现结核杆菌精准识别，为痰涂片检测提供了革新方案，尤其适用于资源有限地区的结核病快速筛查。

图三：（A） 痰液样本与 N14G 或 N14G-Fe 一起孵育的程序图示（B） 使用 N14G （0.1 μM） 标记牛分枝杆菌 BCG 和 H37Rv 10 分钟的图像。比例尺，5 μm。（C） 用 N14G （0.1 μM） 和 N14G-Fe （0.1 μM） 或 AO 试剂处理 10 分钟的结核病患者的痰液样本图像。比例尺，5 μm。

本研究通过将分枝杆菌素（MbT）与荧光探针偶联，开发出靶向结核分枝杆菌 IrtAB 铁转运系统的双功能探针 N14G 及 N14G-Fe，实现了结核病的超灵敏快速诊断。探针利用 Fe³⁺螯合淬灭荧光特性，在胞外形成 “信号关闭” 状态，进入菌体后经 IrtAB 介导的 Fe³⁺还原释放 Fe²⁺并激活荧光，形成特异性 “开关” 响应。实验表明，N14G 在 1 nM 浓度下 5 分钟内即可检测耻垢分枝杆菌（荧光增强 19 倍），而 N14G-Fe 对结核杆菌 H37Rv 的检测限低至 34 CFU，并在 0.1 μM 浓度下 10 分钟内有效标记牛分枝杆菌 BCG 及临床痰样中的结核杆菌。研究揭示 IrtAB 兼具探针运输与荧光激活的双重功能，同时发现分枝杆菌细胞壁或存在未知的非铁依赖 MbT 转运途径。该策略突破传统检测方法灵敏度与时效性瓶颈，为结核病即时诊断及耐药菌监测提供了革新性工具，未来可通过优化探针铁代谢响应机制进一步拓展临床应用。

原文doi：https://doi.org/10.1021/acscentsci.4c00676