1. 引言

微生物食品安全仍是全球公共卫生的一大挑战，每年全球有6亿人患病，42万人死亡，经济损失巨大。传统的基于培养的检测方法耗时且不适合连续监测。先进的基因型和免疫学技术虽然速度更快，但仍需要复杂的样品处理和设备。为应对这些挑战，各国推动利用人工智能、机器学习和传感器技术开发便携式检测系统。新兴的比色传感器阵列（CSA）技术通过识别细菌代谢产物提供了持续监测的可能，但仍需优化。

本研究报道了一种基于中温阿尔戈驱动的多分散微滴反应器和机器学习的一锅信号增强食源性病原体检测数字平台。首先构建了不对称RPA与cbago定向精确识别相结合的一锅反应机制（图1A）。添加不同比例的正向引物（引物丰富）和反向引物（引物有限）。重组酶辅助特异性引物与互补DNA模板结合后，由聚合酶及相关辅因子启动双链DNA合成。gDNA触发ssDNA扩增子的初级切割，从目标产生更新的gDNA，然后指导具有荧光团修饰的报告探针的二级特异性切割。不同的靶标产生不同的荧光信号，实现多重检测，荧光强度也揭示了靶标的浓度，而非特异性靶标ssDNA无法促成荧光信号的触发。37°C一锅反应后，使用普通倒置荧光显微镜拍摄图像，并使用基于机器学习的自动图像处理对获得的荧光原始图像进行分析（图1B）。然后结合机器视觉算法提取荧光微滴的面积和图像强度作为双参数进行信号分析。最后，我们建立了基于机器学习的基于双参数的RFR模型，实现了对不同目标的智能自动准确量化。

图1. DRAGON一锅同时检测不同食源性致病菌的工作流程示意图

2. 结果与讨论

CbAgo蛋白的表达、纯化及特性研究

研究表达并纯化了CbAgo蛋白，该蛋白形成双叶支架结构。通过电泳和MALDI-TOF/TOF分析，确认纯化蛋白的分子质量约为87840 Da，符合预期。这表明CbAgo蛋白已成功获得，可用于进一步应用。

不对称RPA-CbAgo反应体系的机理

本研究开发了一种不对称RPA-CbAgo反应体系，用于检测鼠伤寒沙门氏菌。该体系通过CbAgo识别和切割RPA产生的单链DNA，实现信号输出。优化后的反应条件确保了高效切割和特异性，避免了非特异性信号。该系统在37℃下运行，无需高温或解旋酶，检测限为93 CFU/mL。为进一步提高灵敏度，研究尝试在多分散微滴反应器中进行信号增强。

图2. 不对称RPA-CbAgo反应体系的表征及反应机理。

多分散微滴反应器的建立与优化

研究使用玉米油与乳化剂聚甘油酯聚蓖麻油酸酯（PGPR）制备多分散微滴反应器，实现了一锅反应的兼容性。通过优化乳化剂用量和微滴生成时间，确定了最佳条件（玉米油与乳化剂比例为500:35，生成时间约30秒）。该反应器在37℃下保持稳定，适用于嗜中温Ago蛋白的数字核酸检测，实现了超灵敏检测。与传统方法相比，降低了制备难度、成本和时间。

基于机器视觉的信号提取

使用ImageJ对多分散微滴图像进行分析，但常规软件处理精度不够。为此，开发了一种自动集成图像处理系统。通过小波背景去噪和双边滤波算法，解决了边界模糊问题。采用自适应阈值分割算法，利用微滴横截面积和荧光强度作为双参数，提高了识别精度。该系统实现了高通量批量自动图像识别，减少了人工处理，提高了分析效率。

图3. 建立了一种基于单釜多分散微滴反应器的反应系统及过程的自动化机器视觉图像。

机器视觉对鼠伤寒沙门氏菌的分析性能及基于机器学习的RFR模型建立

本研究评估了DRAGON系统在检测鼠伤寒沙门氏菌方面的能力。结果显示，微滴反应器的面积和荧光强度与DNA浓度相关良好，线性区间为93 CFU/mL至9.3×10⁶ CFU/mL。通过机器学习模型（RFR），提高了定量检测的精度，预测值与实测值之间的相关性为0.9922。该系统的检测限为2 CFU/mL，特异性实验表明其在单靶点检测中表现出色。

图4. 用DRAGON检测食源性致病菌鼠伤寒沙门菌的单靶点。

一锅DRAGON用于不同病原体的检测

本研究在多分散微滴反应器中实现了单核增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的单目标和双目标检测。结果显示，微滴面积和荧光强度与细菌浓度相关良好，线性回归方程的R²值高于0.96。双目标检测中，两种病原体之间无干扰，检出限为2 CFU/mL。该系统使用机器学习模型进一步提高了检测精度和特异性，优于传统CRISPR/Cas12技术。

图5. 用于双病原体一锅检测的DRAGON的研制。

DRAGON在实际样品中病原菌检测中的应用

本研究测试了DRAGON系统在实际样本中检测食源性致病菌的可行性。共检测了80个肉类样本和20个临床样本，结果显示13份样本中仅有鼠伤寒沙门氏菌阳性，5份仅有单核增生李斯特菌阳性，3份两种病原体均阳性。DRAGON的检测结果与标准qPCR方法一致，证明了其准确性和在食品生产中的应用价值。DRAGON系统不依赖热循环器，减少了检测时间，提高了灵敏度。

图6. DRAGON在实际应用中的程序及其与其他方法的比较

3. 总结

本研究设计了一种基于中温Ago蛋白的智能多分散微滴反应器数字核酸检测平台。这是首次采用中温Ago进行真正意义上的一步一锅数字化核酸靶标检测。该平台利用多分散微滴反应器制备系统，与高效的基于机器学习的图像处理技术相结合，取代了昂贵的单分散微滴制备设备。这种创新解决了传统数字平台在图像识别方面缺乏准确性和智能自动化的问题。因此，DRAGON代表了下一代基于基因编辑技术的分子诊断平台和数字核酸系统。未来，通过对Ago蛋白进行进一步修饰，可以提高其裂解活性和稳定性。将该平台与逆转录扩增相结合，可以扩大其应用范围至RNA靶点检测。此外，增加多路检测通道和吞吐量，并结合微流控芯片和便携式显微镜，将有助于克服与样品制备、反应温度控制、信号读出和分析自动化相关的挑战。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.148845