肠道菌群的“隐身术”：毛螺菌科的免疫逃逸之谜

肠道微生物群（gut microbiota）是人体内一个复杂且多样化的微生物生态系统，对宿主的健康和疾病有着深远的影响。这些微生物参与消化、代谢、免疫调节等多种生理过程，但许多肠道细菌难以在体外培养，且难以直接观察，这给研究带来了巨大挑战。因此，开发能够特异性标记特定细菌群体的工具对于深入理解肠道微生物群的功能和多样性至关重要。尽管近年来已经开发出一些选择性标记方法，但这些方法通常只能标记较广泛的细菌群，无法实现对特定属或科的特异性标记。为了更深入地研究特定细菌群体的功能，开发能够特异性标记肠道微生物群中特定科或属的探针显得尤为重要。例如，毛螺菌科，包含多个属，如罗氏菌属和普拉梭菌属，这些细菌在维持肠道健康和调节宿主免疫方面发挥着重要作用。然而，目前缺乏能够特异性标记这一科细菌的工具，限制了对它们功能的研究。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，其合成过程中涉及多个酶促反应。MurC酶负责将L-氨基酸连接到UDP-N-乙酰胞壁酸（UDP-MurNAc）上，形成肽聚糖茎肽的第一个氨基酸。尽管大多数细菌在这个位置使用L-丙氨酸（L-Ala），但存在一些变异性，例如某些细菌可以使用甘氨酸（Gly）或L-丝氨酸（L-Ser）。基于肽聚糖茎肽中氨基酸的多样性，复旦大学王炜团队及厦大/上海交大杨朝勇团队设计了一种能够特异性标记毛螺菌科细菌的荧光L-氨基酸探针（FLAA），此探针通过细菌自身的代谢途径整合到肽聚糖中（图1），从而实现对特定细菌群体的标记。

此研究共有2大主要发现：

（1）FLAA的标记位点及标记机制。通过利用含有炔基的L-丙氨酸（LPG）标记粪罗斯氏菌，结合质谱分析，研究者首次发现了新的标记位点：LPG取代了通常存在的L-丙氨酸（L-Ala），并被整合到了肽聚糖茎肽的第一个氨基酸位置。这一整合过程与RfMurC酶密切相关，RfMurC酶能够将非L-丙氨酸的氨基酸（如LPG和TALA）整合到UDP-MurNAc中。相比之下，大肠杆菌的MurC酶（EcMurC）对这些非典型氨基酸的耐受性较低，这也是为什么FLAA不能有效标记大肠杆菌的主要原因（图2）。

（2）共生菌的免疫逃逸机制。FLAA的独特标记机制揭示了毛螺菌科肽聚糖中第一个氨基酸的可变性。基于此，研究者探索了含有不同氨基酸（第一个）的肽聚糖对宿主免疫受体NOD1和NOD2的激活能力。结果显示，含有非典型氨基酸（如L-丝氨酸和LPG）的肽聚糖片段对宿主NOD1和NOD2的激活能力显著降低（图3）。这一发现表明，毛螺菌科细菌通过在肽聚糖中整合非典型氨基酸，降低了对宿主免疫系统的激活能力，从而在肠道中长期稳定存在。这种机制可能是一种进化上的适应策略，帮助这些共生菌逃避宿主的免疫识别。

总的来说，文章通过开发和应用FLAA，揭示了毛螺菌科细菌在肠道微生物群中的特异性标记机制及其免疫逃逸策略。这些发现不仅为理解肠道微生物群与宿主健康之间的关系提供了重要的科学依据，还为开发新的治疗策略提供了潜在的应用方向。不过，FLAA标记策略在毛螺菌科中应用并不够全面，甚至于在属中也存在应用缺陷。另外，本研究实验还停留在体外或者小鼠体内层面，尚未真正进行临床试验。这些局限性在未来有待进行深入研究。

图1  FLAA探针在体内对小鼠肠道微生物群的标记效果和特异性。（a）FLAA探针的化学结构，可根据需要标记相应的荧光基团：FAM（FALA），TAMRA（TALA），Cy5（Cy5ALA）。（b）FALA标记的小鼠盲肠细菌的流式细胞术分析结果。结果显示约14.6%的肠道微生物被标记。（c）FALA标记的小鼠盲肠细菌的共聚焦荧光显微镜图像。标记的细菌呈纺锤形，荧光主要集中在细胞表面。（d）FALA和TAMRA-氨基-D-丙氨酸（TADA）标记的小鼠盲肠细菌的共聚焦荧光显微镜图像。两者的信号高度重叠，表明FLAA标记的是肽聚糖。（e）FALA标记的小鼠盲肠细菌经过突酶（一种裂解肽聚糖的酶）处理前后的流式细胞术分析结果。处理后，FALA标记的荧光强度显著降低。（f）TALA和Cy5ALA顺序标记（间隔3 h灌胃）的小鼠盲肠细菌的共聚焦荧光显微镜图像。TALA标记的信号主要位于细胞侧面，而Cy5ALA的信号主要集中在细胞分裂的中点区域。

图2  （a）LPG（相对探针成本较低）标记粪罗斯氏菌的实验设计。LPG被整合到肽聚糖中后，通过点击化学反应与带有叠氮基团的荧光染料（如Alexa Fluor-488）结合，从而实现荧光标记。（b-c）未标记粪罗斯氏菌的肽聚糖质谱分析。（d-e）LPG标记粪罗斯氏菌的肽聚糖质谱分析。（f）RfMurC酶的反应示意图。粪罗斯氏菌的MurC酶（RfMurC）催化LPG和TALA（TAMRA-氨基-L-丙氨酸）与UDP-N-乙酰胞壁酸（UDP-MurNAc）结合的反应。（g-h）基于液相色谱-质谱的RfMurC酶的酶活性分析。（i）RfMurC和大肠杆菌的MurC酶（EcMurC）对不同氨基酸底物（L-丙氨酸、L-丝氨酸、LPG）的酶动力学参数。

图3  （a）通过质谱分析L-丝氨酸标记的粪罗斯氏菌的肽聚糖片段（含有不同氨基酸）的峰面积。（b）NOD1的天然激动剂（Tri-DAP，即L-丙氨酸-D-异亮氨酸-meso-二氨基庚二酸）及其类似物（如L-精氨酸-D-异亮氨酸-meso-二氨基庚二酸）的化学结构。（c）NOD2的天然激动剂（MDP，即MurNAc-L-丙氨酸-D-异亮氨酸）及其类似物（如MurNAc-L-精氨酸-D-异亮氨酸）的化学结构。（d）使用第一位含有不同氨基酸的肽聚糖片段刺激NOD1报告细胞系（HEK Blue mNOD1），测试其对NOD1的激活能力。（e）不同浓度的NOD1激动剂（包括Tri-DAP及其类似物）对NOD1激活能力。（f）不同浓度的NOD2激动剂（包括MDP及类似物）对NOD2的激活能力。

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202503049