颠覆癌症诊断！drFRET技术实现sEV糖基化RNA超灵敏成像，临床准确率达100%

研究背景

糖基化RNA（glycoRNA）是近年发现的一类膜相关分子，其糖链修饰（如唾液酸）可介导细胞间通讯、免疫调控等功能（图1a）。例如，glycoRNA通过与内皮细胞上的P-选择素（P-selectin）结合，促进中性粒细胞募集至炎症部位。然而，传统检测方法依赖代谢标记或质谱，步骤繁琐且无法实现原位分析。

sEVs是细胞分泌的纳米级囊泡（30-150 nm），携带母细胞的蛋白质、核酸、糖链等生物信息，是癌症液体活检的理想标志物来源。但现有sEVs检测多聚焦于蛋白质或非糖基化RNA，而sEVs表面glycoRNA的临床潜力尚未被挖掘。

传统方法（如RNA印迹、点击化学）需复杂预处理（如代谢标记），且无法同时提供序列和空间信息（图1c）。亟需一种高灵敏度、无需标记的原位检测技术！

图1 sEV上存在glycoRNA

研究原理

为了锁定sEVs上的glycoRNA，研究人员设计了双探针：

- 糖链探针（GRP）：特异性识别唾液酸（Neu5Ac），标记Cy3荧光染料（图2a）。

- RNA探针（ISHP）：与目标RNA序列杂交，标记Cy5荧光染料（图2a）。

图2 用于原位成像sEV glycoRNA的drFRET的开发

当GRP与ISHP同时结合到glycoRNA的糖链和RNA部分，且两者距离<10 nm时，Cy3（供体）的能量通过非辐射共振转移至Cy5（受体），产生FRET信号（图2b）。通过校正光谱串扰（sensitized emission法），可精准量化glycoRNA丰度（图2c）。

为了实现使用sEVs捕获与成像，研究人员采用HER2适配体功能化微珠（fcPS）富集sEVs，结合drFRET实现高通量成像（图3b）。实验验证显示，RNase或唾液酸酶处理可显著降低信号，证明技术特异性（图3f-g）。

图3 癌症来源的sEVs上glycoRNA的原位FRET成像

研究亮点

1. 超高灵敏度与特异性

- 检测限低至7.7×10⁴ particles/mL，线性范围横跨4个数量级（图4b）。

- 通过酶处理（RNase、唾液酸酶）和探针替换实验（图3g），验证信号仅来源于glycoRNA的糖链-RNA双识别。

图4 7个细胞系中的sEV glycoRNA的FRET成像

2. 无需代谢标记，直接检测天然glycoRNA

传统方法依赖代谢标记（如Ac₄ManNAz），而drFRET可直接分析临床样本（图5a），避免标记引入的偏差。

图5 原位FRET成像揭示了癌症中的多种glycoRNA改变

3. 极低样本需求与快速检测

仅需10微升血清，70分钟内完成从sEVs富集到成像的全流程（图1c，图4a），适用于临床即时检测。

4. 多癌种诊断能力

在100例临床样本（6种癌症 vs. 非癌对照）中：

- 癌症 vs. 非癌：100%准确率（AUC=1）（图5b-c）。

- 多癌种分类：**89%总体准确率**（图6c-d），优于传统sEV蛋白标志物。

图6 通过sEV glycoRNA谱实现准确的癌症诊断

效果展示

1. sEVs表面glycoRNA的直观成像

TEM与drFRET联用，清晰显示glycoRNA在sEVs表面的分布（图1d-e，图3a）。

2. 癌症诊断的ROC曲线与热图分析

5种glycoRNA（U1、U3、U35a、U8、Y5）的组合特征（sEVSUM）在训练集和验证集中均实现完美区分（图5a-c）。

3. 多癌种分类的可视化验证

主坐标分析（PCoA）显示不同癌症样本在二维空间显著分离（图6c），胰腺癌与肝癌的区分尤为明显。

未来展望

drFRET可扩展至其他疾病（如自身免疫病、神经退行性疾病）的glycoRNA标志物挖掘，推动精准医疗。结合超分辨显微技术或纳米流式，实现单个sEV的glycoRNA定量，提升检测灵敏度。调控glycoRNA与Siglec受体的相互作用，或可抑制sEVs介导的肿瘤转移。未来可以开发广谱RNA探针，覆盖未知序列的glycoRNA，并且整合自动化设备，实现临床检测标准化。这项研究不仅革新了glycoRNA的检测范式，更开辟了sEVs在癌症诊断中的新维度。drFRET技术的临床转化，或将推动液体活检进入“glycoRNA时代”，为亿万患者带来早诊早治的希望！

DOI: 10.1038/s41467-025-58490-2