基于活性银纳米粒子吸附细菌的“磁铁”通过表面增强拉曼散射预测难治性根尖

1.引言

难治性根尖周炎（RAP）主要由粪肠球菌引起，检测该细菌对于早期预防和治疗至关重要。传统的检测方法，如LAL法和ELISA法，特异性较差，而DNA-DNA杂交和16SrRNA高通量测序技术虽然特异性高，但操作复杂。表面增强拉曼散射（SERS）技术具有快速、高灵敏度和高特异性，但在直接检测细菌时遇到挑战，通常需要特异性探针修饰。因此，开发一种简便、快速的粪肠球菌检测方法具有重要意义。活性银纳米粒子吸附细菌的“磁铁”结合SERS技术可能提供新的解决方案。机器学习最近被应用于基于SERS技术的细菌检测。尽管通过机器学习可以实现不同类型细菌之间的快速高效区分，但关于细菌分子的检出限以及定量细菌浓度与SERS强度之间的相关性的研究尚未见报道。因此，机器学习和无标记SERS技术的深度集成仍然值得探索。

本研究报道了一种基于SERS的直接检测细菌的方法，可以准确地识别未标记的粪肠球菌和真实的临床样本。过量的硼氢化钠被用来动态维持银纳米粒子的表面活性，并加入Na+使银纳米粒子两次聚集，形成适合细菌分子的良好热点。利用该方案探讨粪肠杆菌浓度下限及粪肠杆菌浓度与SERS峰强度的关系。此外，结合机器学习识别技术，评估了该方案区分不同菌株的能力，包括粪肠杆菌、牙龈卟啉卟啉菌、变形链球菌和大肠杆菌。此外，还验证了纳米银的老化和抗菌作用。

2.结果与讨论

SERS衬底的表征

本研究制备了一种Na+诱导的纳米银粒子聚集的增强底物，用于直接获得病原菌的SERS信号。通过硼氢化钠还原剂，银纳米粒子持续吸附生物分子，获得初始增强的SERS信号。Na⁺聚集剂使银纳米粒子聚集在细菌表面，进一步增强SERS信号。该系统无需额外标记物即可获得细菌的特征指纹，并结合机器学习技术进行快速识别和区分。

图1.SERS衬底的表征

SERS衬底的再现性

本研究表明，直接检测纯粪肠杆菌或使用聚合器时，未观察到SERS信号，反映了银纳米颗粒作为SERS增强底物的必要性。该检测平台增强了粪肠杆菌的SERS信号，验证了其可重复性和稳定性。不同浓度的粪肠杆菌显示出一致的SERS特征峰，表明该方法具有良好的重复性和检出限。即使在低浓度下，也能检测到粪肠杆菌的SERS信号。

图2.SERS衬底的再现性

口腔细菌的特异性SERS检测

本研究检测了粪肠杆菌、牙龈卟啉链球菌、变形链球菌和大肠杆菌的SERS光谱，发现每种细菌的SERS手指模式有显著差异。通过主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA），成功区分了这四种细菌。结合人工智能技术，实现了SERS光谱的快速解读，使检测结果更为直观。这种方法提高了临床样品的检出率，并为快速检测提供了技术基础。

图3.口腔细菌的特异性SERS检测

粪肠杆菌的定量SERS检测

研究表明，根管内粪肠球菌的存在与难治性根尖周炎（RAP）密切相关。通过SERS技术，研究了粪肠杆菌浓度与拉曼峰强度的关系。随着浓度的增加，SERS信号强度呈现增加趋势，尤其是998cm^-1的蛋白信号峰。构建的峰值强度比与浓度呈良好的线性关系（R²=0.9996），表明该系统对粪肠杆菌浓度具有较高的敏感性，具有良好的定量应用潜力。

模拟样品中粪肠杆菌的检测

该研究模拟了唾液、血清和混合细菌样本，以验证SERS系统在临床样本中的应用。结果表明，即使在唾液或血清中，该系统仍能准确识别粪肠杆菌的SERS信号。即使与牙龈假单胞菌混合，仍能区分粪肠杆菌的特征峰。该系统显示出强大的识别能力，适合检测复杂混合物中的粪肠杆菌，为真实临床样本检测提供了理论支持。

图4.粪肠杆菌的定量SERS检测以及模拟样品中粪肠杆菌的检测

真实临床标本中粪肠杆菌的检测

通过分析牙髓炎、根尖周炎、第二根管治疗和无牙病的临床样本，发现根尖周组和第二根管治疗组中存在粪肠杆菌的SERS信号。由于样本中含有多种细菌，可能出现重复的SERS峰，但仍能确认粪肠杆菌的存在。该方法显示出检测临床样本的潜力，有助于评估疾病难治性并选择有针对性的治疗方案。与传统的克林霉素培养法相比，SERS检测更快速、方便

图5.真实临床标本中粪肠杆菌的检测可行性验证

该研究验证了SERS检测方法的下限为1×10⁵cfu/mL，并通过层次聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）确认其可行性。银纳米颗粒不仅能有效检测粪肠杆菌，还具有强大的抗菌活性，且环保。该方法弥补了口腔临床诊断的缺陷，使疾病诊断更加准确，为预防和治疗提供了证据支持。

图6.真实临床标本中粪肠杆菌的检测限验证

3.总结

本研究设计了一种无标签口腔细菌检测新技术，利用Na⁺作为聚集剂促进Ag@BO和Ag@BON纳米粒子的形成，从而获得高信噪比、重现性好的细菌SERS谱。该方法的检出限可达1×10⁵ cfu/mL，并通过乙腈（ACN）作为内标，发现I998/I927与粪肠杆菌浓度梯度增加呈良好的线性增长关系。通过与机器学习识别技术相结合，成功地识别和区分了四种不同类型的细菌。该方法能够准确鉴别唾液、血清、混合菌及真实临床样品中粪肠杆菌的特征SERS信号表达，对预测根尖周炎症向难治性根尖周炎（RAP）的转变具有重要的指导意义。此外，合成的纳米银不仅使用寿命长达30天，而且具有很强的抗菌和杀菌能力。这使得该方法适合在医院和其他检测机构使用，不会对医疗环境造成污染，并在很大程度上避免了医院感染。这种集成检测和杀菌功能的方法，为快速鉴定病原菌提供了新方案，并为选择合适的治疗方案提供了理论依据。

论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.3c16677