线虫神经元“基因密码”被破译！两种测序技术强强联合，揭示基因表达新奥秘

秀丽隐杆线虫由于其神经系统的独特优势，成为了此次研究的理想模型。它的整个神经系统仅包含302个神经元，却分为118种不同的解剖学神经元类型，且每个神经元的结构、连接和谱系都已基本明确。然而，以往的研究技术存在一定的局限性。之前的scRNA-seq技术虽然已经绘制出基因表达图谱，但在检测低表达基因和非多聚腺苷酸化转录本时效果欠佳。而bulk RNA-seq技术虽然在某些方面能够弥补scRNA-seq的不足，却容易受到非靶细胞转录本的污染。

为了克服这些难题，研究团队针对118种经典神经元类别中的52种，开展了bulk RNA-seq样本的制备工作。研究人员巧妙地运用特定的线虫品系，借助荧光激活细胞分选技术（FACS），成功地从复杂的细胞群体中分离出单个神经元类型，随后利用随机引物构建测序文库，从而实现了对各种RNA的全面检测。

研究内容

图 1 通过靶向标记表达和FACS分离进行单神经元批量RNA测序

如图1展示了实验流程和神经元基因表达特征差异。以AVL神经元为例，图1A详细描绘了实验的具体操作过程。研究人员利用flp-22::GFP和unc-47::mCherry这两种标记物给AVL神经元贴上独特的“标签”，再通过FACS技术，从解离的L4期幼虫细胞中精准地将其分离出来，随后对提取的RNA进行批量测序。图1B通过PCA图展示了不同功能类型的神经元（如感觉神经元、运动神经元和中间神经元）的基因表达差异。这些神经元类型在图中被清晰地区分开来，说明测序策略能够有效区分不同类型神经元的基因表达特征，为后续研究奠定了基础。

图 2 LittleBites识别并去除批量数据中的污染原理

为了解决bulk RNA-seq数据的污染问题，研究团队创新性地开发了“LittleBites”算法。从图2中，我们可以清晰地看到该算法的工作原理和显著效果。首先它会估计细胞类型的比例，接着去除不属于目标神经元的“杂质”，然后通过与“ground truth”基因进行对比，来不断优化处理效果（图2A）。从图2B、C图的ROC曲线对比中，我们能直观地发现，经过LittleBites算法处理后的数据准确性得到了显著提升。“LittleBites”算法就像一个高效的“过滤器”，在去除非神经元污染的同时，最大程度地保留了神经元特异性表达信号。

图 3 sc-RNAseq数据中细胞比例与基因计数之间关系的模型

为了整合两种测序数据，研究人员优化了单细胞数据的分析方法。图3A对比了scRNA-seq数据中的聚合计数和比例测量。图3B通过ROC曲线显示比例测量比聚合计数更准确。图3C和D展示了基因计数与细胞比例的关系。基于这些发现，研究人员开发了scProp2Count数据集，其在基因检测灵敏度和与“真实情况”的相关性上更优。

整合bulk RNA-seq和scRNA-seq数据集后，研究人员发现基因检测准确性显著提升。研究显示，整合数据集在检测神经元“ground truth”基因时，展现出更高的真阳性率和更低的假阳性率。并且在5%错误发现率的严格标准下，其灵敏度远超其他数据集。此外，对ADL和VB神经元的分析显示，整合数据集能有效减少其他细胞类型的污染，精准反映神经元的基因表达特征。

图 4 批量RNA测序检测到单细胞测序未发现的蛋白编码基因

研究还发现，bulk RNA-seq具有独特的优势，能够检测到scRNA-seq遗漏的低表达蛋白编码基因。图5A揭示了小簇神经元在基因检测上的不足，暗示bulk数据中可能包含scRNA-seq遗漏的信息。图5B显示，整合数据集在单细胞数据覆盖不足的细胞类型中，能检测到更多额外的蛋白编码基因。图5C直观展示了各细胞类型在bulk数据中检测到的新蛋白编码基因数量。

在非编码RNA的研究中，研究人员也取得了显著进展。他们发现，在广泛表达的“泛神经元”非编码RNA中，snoRNAs和snRNAs的占比远高于预期，这表明它们可能在神经元中发挥着重要的、广泛的作用。此外，在神经元特异性非编码RNA中，未分类的ncRNAs和假基因占据了较大比例，这为后续研究非编码RNA的功能提供了新的方向。研究人员还详细展示了不同神经元类型中特异性非编码RNA的表达情况，并揭示了ADL神经元中特异性GPCR假基因与真正GPCR基因表达之间的关联。这一发现暗示假基因可能在神经元的功能调控中扮演重要角色。

这项研究通过整合批量和单细胞RNA测序技术，为秀丽隐杆线虫神经系统的研究提供了更全面、准确的基因表达图谱。这一成果不仅有助于深入理解神经元多样性和功能的分子基础，还为未来研究神经系统发育、神经退行性疾病等提供了重要的数据资源和分析工具。此外，该研究提出的数据整合策略也为其他领域的转录组学研究提供了新的思路和方法。

原文链接：https://doi.org/10.1101/2025.01.26.634951