A-MALDI：肠杆菌科碳青霉烯类酶的精准鉴定与亚型分析

产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌（CPE）的传播已成为三级医院，尤其是长期护理机构（LTCFs）中亟待解决的重要临床问题，这些机构往往存在感染控制方面的缺陷。碳青霉烯酶能够水解碳青霉烯类抗生素，导致细菌对这些抗生素产生耐药性，极大地增加了治疗难度。CPE感染的死亡率高，其耐药基因常位于移动遗传元件上，传播能力极强。因此，准确识别CPE中的碳青霉烯酶变体对制定有效的感染控制和治疗策略至关重要。以KPC家族为例，其变体繁多，突变不仅影响治疗方案和抗生素的选择，还存在“跷跷板效应”：某些突变可能使细菌对一种抗生素（如头孢他啶/阿维巴坦）产生耐药性，但同时可能会恢复对另一种抗生素（如亚胺培南）的敏感性。目前，针对CPE的检测已开发出多种方法，如基于培养的方法、比色测试（如CarbaNP测试）、PCR以及侧向流动免疫色谱测试等。然而，这些方法均存在一定缺陷，有的需要额外的培养步骤、依赖细菌生长速率，有的成本高昂、需要专业技术人员操作，还有的检测灵敏度较低，并且都无法区分CPE蛋白或基因的亚型。MALDI-TOF MS作为临床微生物学领域的有力工具，能够同时检测多种蛋白并依据质荷比（m/z）测定其分子质量，在多种碳青霉烯酶检测方面颇具潜力。

本研究团队此前开发了OS-MALDI方法用于检测KPC蛋白。在此基础上，本研究整合了渗透休克裂解、内部质量校准、有机溶剂提取等多项技术，研发出先进的MALDI-TOF MS方法（A-MALDI），以实现对CPE及其碳青霉烯酶亚型的精准鉴定。相较于OS-MALDI，A-MALDI在样本处理和质谱分析方面进行了多项改进，这些改进使得A-MALDI在检测碳青霉烯酶及其亚型方面具有更高的准确性和灵敏度（图1）。作为方法验证，作者从韩国的18家长期护理机构和15家其他医院收集了581个临床样本，包括469个CPE样本和112个非CPE样本。A-MALDI对所有收集的CPE分离株识别准确率和精密度高达100%，通过对不同酶设定合理质量容差，能够成功区分各个碳青霉烯酶亚型，如KPC-2与KPC-4、OXA-48与OXA-181与OXA-232、GES-5与GES-24，且能够同时鉴定共产生碳青霉烯酶的菌株，如KPC和NDM、KPC和OXA、KPC和GES、NDM和OXA；识别结果与PCR和DNA测序结果高度一致。

总的来说，本研究开发了A-MALDI技术，通过整合优化的MALDI-TOF设置、内部质量校准（In-Cal）过程以及针对NDM检测的有机溶剂提取步骤等多种技术，显著提高了检测的准确性和检测范围。与传统方法相比，A-MALDI在检测高分子量蛋白（>20 kDa）时，展现出更高的质量准确性和检测能力。此外，本研究首次利用MALDI-TOF MS在临床分离株中同时检测KPC、NDM、OXA和GES等多种完整的碳青霉烯酶，填补了相关检测领域的空白，为临床快速准确检测提供了新途径。然而，本研究也存在一些局限性。首先，由于样本收集的限制，未能收集到携带VIM和IMP的样本，且由于韩国CPE流行分布的特点，特定亚型（如OXA-181、GES-5和GES-24）的样本数量相对较少，这限制了对这些亚型检测结果的全面评估。其次，本研究主要关注CPE中碳青霉烯酶的鉴定，未来是否能够将A-MALDI技术应用于非CPE细菌（如铜绿假单胞菌）的检测，还需要进一步研究和验证。未来的研究可以考虑扩大样本范围，包括更多种类的碳青霉烯酶和不同来源的临床样本，以进一步验证A-MALDI技术的普适性和有效性。

图1  A-MALDI和OS-MALDI在KPC-2检测中的分析性能测试比较。（A）A-MALDI（红圈）和OS-MALDI（灰方块）的质量误差比较。A-MALDI的m/z分布更接近KPC-2理论m/z值。A-MALDI的质量误差明显小于OS-MALDI，其m/z方差从OS-MALDI的581.42降至1.11，降低了580倍，突出了A-MALDI 在检测 KPC-2 时质量准确性更高。（B）OS-MALDI（上）和A-MALDI（下）检测KPC-2时的信号强度分布。A-MALDI的KPC-2 阳性信号相比OS-MALDI有4.7倍的提升，同时KPC-2阴性菌株的噪声降低了9.7倍。

图2  A-MALDI方法在检测和区分碳青霉烯酶及其亚型方面的性能和结果。（A）多种碳青霉烯酶亚型的m/z分布。根据碳青霉烯酶亚型的理论m/z值，用虚线标出了鉴定截止范围。（B）A-MALDI在临床样本中的应用结果，包括不同亚型的检测情况和准确性。每个圆圈代表一种被鉴定的CPE亚型，圆圈的重叠区域表示在单个临床分离株中共同表达的多种CPE亚型。图中数字表明了A-MALDI鉴定出的各亚型数量与先前通过PCR和DNA测序确认的数量一致。 

原文DOI: 10.1128/jcm.01475-24