游离DNA（cfDNA）作为一种新兴的液体活检生物标志物，在疾病诊断中具有重要作用，尤其是在癌症早期诊断方面。然而，传统的cfDNA检测方法通常依赖于目标特异性引物和信号放大策略，容易产生假阳性结果。

《Analyst》杂志发表了一项由Ming Li、Ting Zheng等人完成的研究成果，开发出一种基于CRISPR-Cas12a系统的比色法，可快速、准确且灵敏地检测游离DNA（cfDNA），为癌症早期诊断带来新希望。

研究内容

图 1 所建立的游离DNA（cfDNA）检测方法的工作机制

如图1，从原理上看，该技术的传感系统包含Cas12a、crRNA、H0@MBs、双发夹探针（DH probe）和ppi探针。以与乳腺癌密切相关的BRCA-1基因为例，它能优先与crRNA结合并激活Cas12a，随后Cas12a会降解H0@MBs中的DNA片段，使RNA片段暴露。经过磁分离后，H0探针的RNA序列引发DH探针的杂交反应，激活自杂交，“3*”作为引物在DNA聚合酶作用下进行链延伸。延伸过程中，5′端硫代磷酸酯（PS）修饰区域会解离并自折叠形成发夹结构，促使聚合酶启动下一轮自引发扩增循环，产生大量双链DNA产物。而引物延伸产生的焦磷酸盐可被ppi探针识别，引发颜色变化，实现对cfDNA的检测。

图 2 所建立方法的可行性分析

研究人员对该技术进行了全面验证。在可行性分析实验中，通过荧光检测评估Cas12a的反式切割活性和CRISPR-Cas12a的激活情况。结果显示，加入BRCA-1基因后，荧光信号显著增强，证明目标激活的Cas12a-crRNA能够切割H0探针的DNA部分，且H0探针稳定性良好。同时，利用SYBR Green I染料验证自引发介导的链延伸过程，发现只有在“2”序列和DNA聚合酶同时存在时，链延伸才能启动。此外，实验还证实了pp探针介导的颜色变化是由自引发和DNA聚合酶介导的链延伸导致的。

图 3 所建立方法的实验参数优化

为优化检测性能，研究人员对多个实验参数进行调整。确定了DH探针的最佳浓度为100nM，最佳孵育时间为60min，最佳反应温度为37°C，DNA聚合酶的最佳浓度为10U/mL。在优化条件下，该方法展现出卓越的分析性能。检测BRCA-1的灵敏度极高，检测限低至1.04fM，且在检测不同浓度BRCA-1时，吸光度差值（A₀-Aₜₐᵣ₉ₑₜ）与浓度存在相关性。同时，该方法对BRCA-1具有高选择性，即便存在碱基错配的干扰序列，也能精准识别目标序列。

图 4 HEK293和MCF-7细胞培养液中检测到的相对BRCA-1 cfDNA表达水平 

在临床应用潜力探索中，研究人员检测了不同细胞系培养液中的BRCA-1表达水平。结果表明，该方法可有效检测出不同细胞系中BRCA-1的差异，显示出其在多种恶性肿瘤和遗传疾病早期诊断方面的应用前景。

此次开发的比色检测技术操作简便、检测快速，在cfDNA检测领域展现出显著优势，有望推动癌症早期诊断技术的发展，为临床诊断带来新的突破。

原文链接：https://doi.org/ 10.1039/d4an01432d