CRISPR/Cas12a结合点击化学，旋毛虫检测新突破

研究背景

旋毛虫病是一种由旋毛虫属线虫引起的食源性寄生虫病，主要通过食用未煮熟的污染肉类传播。世界卫生组织（WHO）将其列为被忽视的热带病之一，联合国粮食及农业组织（FAO）和WHO将其列为24种食源性寄生虫中最具经济和国际贸易破坏力的首位。目前，人工消化法是检测肉类中旋毛虫污染的金标准，但该方法存在活幼虫感染风险、耗时且劳动强度大。酶联免疫吸附试验（ELISA）因其特异性和稳定性被广泛用于食源性寄生虫检测，但其灵敏度仍需提高。随着CRISPR相关蛋白的发展，CRISPR/Cas系统作为一种敏感的核酸检测工具，已被应用于非核酸目标检测，但FQ探针的高成本和易氧化漂移限制了其实际应用。为解决上述问题，吉林大学团队提出了一种CRISPR/Cas12a介导的点击免疫分析方法（图1），通过将激活单链DNA（ssDNA）和单克隆抗体同时结合到金纳米颗粒（AuNP）上，将CRISPR/Cas12a系统引入免疫分析。利用CuAAC点击化学反应替代传统的FQ探针，设计的ssDNA既是Cas12a的底物，也是人工点击酶铜纳米颗粒（CuNPs）的合成模板，可有效催化CuAAC反应产生信号输出（图2）。

研究原理

本研究提出的CRISPR/Cas12a介导的点击免疫分析方法，具体步骤如下（图1）：

1. 抗原富集：使用涂有抗旋毛虫多克隆抗体的磁珠（MBs@PcAb）富集猪肉中的旋毛虫抗原。

2. 免疫复合物形成：将富集的抗原与AuNP@ssDNA/McAb探针结合，形成三明治结构。

3. CRISPR/Cas12a系统触发：AuNP上的ssDNA激活CRISPR/Cas12a系统，若样本中存在旋毛虫抗原，则Cas12a的横向切割活性被抑制，T20模板保持完整，进而生成ssDNA-CuNPs，催化CuAAC反应产生荧光信号；若不存在旋毛虫抗原，Cas12a的横向切割活性被激活，T20模板被切割，无法生成CuNPs，荧光信号减弱。

研究亮点

- 高灵敏度：检测限低至0.35 ng/mL，比传统ELISA方法（309.75 ng/mL）高三个数量级，可准确检测100克猪肉中的单个旋毛虫幼虫。

- 信号放大：通过AuNP@ssDNA/McAb探针高效标记抗原，同时利用CRISPR/Cas12a系统的横向切割活性和CuAAC反应实现信号放大。

- 操作简便：无需提前制备和储存FQ探针，避免了其高成本和易氧化漂移的问题，简化了实验流程。

- 特异性强：对其他寄生虫（如华支睾吸虫、小袋鼠隐孢子虫和利什曼原虫）具有良好的特异性，不会产生交叉反应。

- 实际应用潜力：在猪肉及其他哺乳动物样本中均展现出良好的检测效果，总检测时间约3小时，适用于多种肉类样本的检测。

效果及展望

在实际样本检测中，该方法成功检测出100克猪肉中的单个旋毛虫幼虫，对20、5、1微克旋毛虫粗蛋白的回收率在92.61%至102.28%之间，符合美国分析化学家协会（AOAC）标准。此外，该方法在猪、狗、鼠、兔四种哺乳动物样本中均表现出对旋毛虫的高度特异性。尽管该方法需要多个实验步骤和一定时间投入，但未来可结合微流控平台技术优化流程，实现更高效、更便捷的现场快速检测（POCT），为食品安全检测提供强有力的技术支持。

图1. CRISPR/Cas12a介导点击免疫分析检测猪肉中旋毛虫的示意图

图2. CuAAC反应催化荧光信号变化

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117521