多机态检测：沙门氏菌和葡萄球菌的检测新方法

1. 引言

食源性病原体对公众健康构成重大风险，因此开发快速准确的检测方法至关重要。细菌的表面结构包含多种生物和化学信息，为检测提供了基础。传统的免疫分析法（如LFIA）已被广泛应用，但其灵敏度受限。新型的三明治结构通过识别不同表面斑点提高了检测效率。聚多巴胺（PDA）作为黏合剂，在结合病原体方面表现突出，但其与不同细菌的结合机制不同。荧光信号因其高灵敏度和最小干扰，在LFIA系统中被广泛采用。通过结合多种信号类型，可以提高检测的精度和灵敏度。

本研究选择了鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作为代表性的革兰氏阳性和阴性菌，将五种结合机制整合到一个多重反应的侧流免疫分析（LFIA）平台中。该平台采用“比色-荧光”双信号检测模式，以提高检测性能。研究中，功能蛋白和IgG蛋白的高亲和力结合、聚多巴胺（PDA）与革兰氏阴性/阳性细菌的非特异性识别，以及细菌与定制纳米材料的物理吸附等机制在一个LFIA系统中得到了证明。通过掺杂铂（Pt）纳米颗粒，PDA的粘附能力得到了增强，信号标签对食源性病原体的亲和力也随之提高。定制的AIE纳米球@PDA@Pt纳米复合信号标签展示了有效的比色和荧光双信号，具有更好的分析性能。最后，该模型成功应用于脱脂牛奶基质中同时检测鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，验证了细菌成分在新型三明治结构检测中的潜力和优势。

方案1. 同时检测鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重mrsd LFIA方案

2. 结果与讨论

双信号标签的表征（AIENS@PDA@Pt）

研究人员通过逐层设计合成了AIENS@PDA@Pt的结构。透射电子显微镜（TEM）显示AIENS颗粒为均匀的球体，平均尺寸为227.2 nm。随后，聚多巴胺（PDA）被组装在AIENS表面，增加了复合材料的分散性，粒径略增至242.7 nm。PDA的附着在TEM图像中可见。利用PDA的还原能力，将铂（Pt）沉积在AIENS@PDA表面，导致颗粒尺寸轻微变化，但显著增加了表面粗糙度。信号标签的zeta电位保持在-30 mV以下，表明胶体稳定性良好。

图1. AIENS@PDA@Pt的表征

研究人员评估了纳米信号标签AIENS@PDA@Pt的比色和荧光信号产生能力。结果表明，PDA和Pt的加载成功提高了吸收曲线。荧光光谱显示最大发射波长为620 nm，Stokes位移为261 nm，这有助于避免荧光自猝灭，提高检测精度和灵敏度。荧光信号的激发和发射波长保持稳定，不受PDA和Pt的影响。在紫外光照射下，荧光信号的还原速率低于比色信号，且在浓度低50倍时仍可检测到荧光信号，表明荧光信号相对于比色信号具有更高的灵敏度。

图2. AIENS@PDA@Pt比色表征及荧光信号的产生

鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重识别机制

细菌表面结构的复杂性使得识别元素多样化。抗原-抗体相互作用是识别细菌的主要机制之一，通过特异性结合实现快速识别。例如，鼠伤寒沙门氏菌与单抗的结合常数（Ka）为2.43×10⁸ M^-1，解离常数（KD）为3.85×10^-9 M。金黄色葡萄球菌的表面蛋白（SPA）可以与哺乳动物IgG的Fc片段结合，Ka为2.03×10⁸ M^-1，KD为2.12×10^-9 M。聚多巴胺（PDA）作为信号标签，与革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）和革兰氏阳性菌的肽聚糖（PGN）结合。铂纳米颗粒的加入增强了信号标签与细菌的结合亲和力。

图3. 鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重识别机制

mrsd LFIA的分析性能

他们开发了一种多重识别的侧流免疫分析（LFIA）系统，结合比色和荧光信号输出模式，以提高检测灵敏度。该系统通过AIENS@PDA@Pt信号标签实现了对鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的同时检测。通过优化标签浓度和检测时间，荧光模式的灵敏度显著提高，检出限分别为500 CFU/mL（鼠伤寒沙门氏菌）和500 CFU/mL（金黄色葡萄球菌）。与比色模式相比，荧光模式的灵敏度提高了40倍和100倍。该系统在特异性测试中表现良好，干扰菌的影响可忽略。

图4. 多mrsd LFIA的分析性能

3. 总结

本研究设计了一种创新性的侧流免疫分析（LFIA）策略，集成了五种不同的识别机制，能够在单个系统中检测革兰氏阴性和阳性细菌。这种“多识别、多检测、多信号”（MRSD）方法代表了食源性病原体检测的重大进展。通过结合比色和荧光信号输出模式，该方法实现了高灵敏度，使其成为实际应用的通用工具。AIENS@PDA@Pt信号标签展示了出色的信号生成能力，荧光信号相比比色信号被放大了50倍，这显著提高了检测灵敏度。这种方法的灵敏度优于传统的LFIA方法，传统方法通常依赖于灵敏度有限的单信号输出。研究结果表明，MRSD LFIA在脱脂牛奶样品中表现优异，回收率在84.59% ~ 110.23%之间，突出了该方法在复杂矩阵中的实用性和可靠性。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.142579