斑点成像：低浓度下无标记快速检测细菌耐药性的高效新策略

抗菌素耐药性（AMR）对全球公共卫生、食品安全和经济发展构成严重威胁。据统计，2019年细菌AMR直接导致127万人死亡，预计到2050年这一数字将升至1000万。应对AMR的策略包括开发新的抗菌药物和加强抗菌管理。然而，开发新抗菌药物面临诸多挑战，例如药物研发周期长、投资巨大、监管严格，且药物寿命相对较短等。因此，合理使用现有抗菌药物和控制耐药菌的传播至关重要，这凸显了抗菌药敏试验（AST）在指导治疗决策和遏制耐药性方面的关键作用。传统的AST方法，如肉汤微量稀释法、纸片扩散法和梯度扩散试验，需要长时间的培养（6-24小时）和额外的1-3天用于分离和确认，这严重阻碍了早期诊断和及时治疗。部分自动化系统虽能在6-12小时内出结果，但样本准备过程繁琐，需使用标记剂、大样本量，且操作成本高。此外，多数快速AST方法要求细菌浓度至少为10⁵ CFU/mL，这对于早期诊断单纯性尿路感染或血流感染等疾病来说浓度过高。许多声称能实现快速或低浓度AST的研究，往往伴随着复杂的样本制备步骤，耗时较长。因此，开发快速、灵敏的AST方法对于早期感染诊断和有效的抗生素管理意义重大。

在此背景下，作者团队曾开发基于机器学习的动态激光散斑成像（DLSI）系统，可在10⁵ CFU/mL细菌浓度下2小时内完成AST，但在更低浓度下实现快速检测仍存在困难。进一步，本研究引入DhLSI系统，通过利用参考光束增强对弱散射信号的检测，结合机器学习算法分析细菌在抗生素作用下的动态散斑模式，成功实现在10³ CFU/mL的低细菌浓度下的快速、无标记AST（图1-图2）。为展示该方法的应用潜力，作者选用了2种模式菌，分别是大肠杆菌（E. coli）和粪肠球菌（E. faecalis），以及两种不同作用机制的抗生素氨苄西林（ampicillin）和庆大霉素（gentamicin）作为研究对象。结果如图3所示，对于大肠杆菌和粪肠球菌，ANN模型均能够准确预测最低抑菌浓度（MIC）值。此外，通过在不同天数开展实验，验证了DhLSI系统在不同条件下的稳定性和可靠性。即使样本相隔数月，系统仍能提供一致的预测结果。

总体而言，文章所研发的DhLSI系统在细菌浓度要求、检测时间、成本和样本制备复杂度方面优势显著（见表 1），为快速、准确检测细菌耐药性提供了更有效的手段，在临床诊断和公共卫生领域具有广阔的应用前景。不过，目前DhLSI主要适用于纯菌的AST分析，且研究中所涉及细菌的代表性尚显不足。另外，获取病原ID也是临床关注的重点问题。DhLSI本身无法获得病原ID，虽可与其他技术（如拉曼光谱）联用（本文已对此进行了初步验证），但这会增加设备成本。未来，可针对这两个方面展开更深入的研究。

图1  DhLSI系统的示意图。（a）激光束与（b）含有不同浓度抗生素的细菌培养液相互作用。（c）信号光束与（d）参考光束结合形成全息图，该图通过（e）CMOS相机记录，总时间为（f）10秒，包含600帧。经过预处理后，（g）傅里叶分析提取有关细菌运动的信息。（h）使用主成分分析（PCA）进行验证和可视化。随后，傅里叶变换结果输入人工神经网络（ANN），用于（i）预测最小抑菌浓度（MIC）。该综合系统集成了全息成像、傅里叶分析、PCA和ANN预测，以实现快速AST。

图2  使用DhLSI系统（a）和传统动态成像系统（b）对不同浓度氨苄西林处理3小时后的大肠杆菌（10³ CFU/mL）进行成像的对比结果。DhLSI系统能够清晰地捕捉到散斑图案的变化，而传统动态成像系统在低浓度下几乎无法检测到任何信号，散斑图像之间几乎没有差异。这表明DhLSI系统在低浓度下具有更强的信号检测能力，能够有效区分受抑制和未受抑制的细菌。

图3  初始浓度为10³ CFU/mL、10⁴ CFU/mL和10⁵ CFU/mL的（a）粪肠球菌和（b）大肠杆菌经氨苄西林处理的机器学习预测结果，以及（c）大肠杆菌经庆大霉素处理的预测结果。初始浓度为10⁵ CFU/mL，10⁴ CFU/mL及10³ CFU/mL的样本抗生素处理时间分别为2 h，2 h和3 h。

表1  DhLSI系统与其他现有的快速AST和细菌鉴定方法比较。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117312