聚糖疾病监测新法：Resol-block-copolymer碳化集成机器学习

肝脏疾病对人类健康构成严重威胁，尤其是肝硬化和肝癌的发病率和死亡率居高不下。肝硬化是一种常见的慢性肝病，早期症状不明显，但长期损害会导致多种并发症，甚至死亡。肝癌多数在晚期才被诊断，治愈难度大，而早期检测肝癌能显著提高生存率。目前，临床检测肝脏疾病主要依赖于组织学和影像学检查，这些方法具有侵入性、成本高且缺乏及时检测所需的客观性。因此，开发一种具有高准确性、高通量、快速处理、用户友好操作和非侵入性能力的强大工具对于提高肝脏疾病检测的精确性、改善生存率和预后至关重要。

糖基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，涉及超过7000种高度保守的N-糖基化蛋白。N-糖基化是指寡糖的半缩醛羟基与新合成蛋白序列中Asn残基的氨基之间的共价结合过程。N-糖基化在内质网和高尔基体中发生，其结构多样且具有多种生物学功能，能够反映许多生理和病理过程。研究表明，癌细胞中糖基转移酶的表达模式与正常细胞显著不同，因此糖蛋白的糖基结构会随着疾病进展而变化，成为客观的糖生物标志物。与蛋白生物标志物相比，基于糖基表达水平和构象变化的生物标志物可能在更高的灵敏度和特异性下实现更精细的疾病分层。然而，目前对于与肝脏疾病相关的糖组学分析或糖生物标志物发现的研究较少。因此，进一步探索和表征血清中的N-糖基对于肝脏疾病的精准检测具有重要意义。

研究内容

图1.MMC-Fe和MALDI-TOF质谱分析富集血清n-聚糖的示意图。

磁性介孔碳（MMC-Fe）的制备与表征：通过resol和三嵌段共聚物复合物引导的碳化方法，成功合成了磁性介孔碳（MMC-Fe）。该方法具有高产率和低时间成本，适用于大规模样品处理。MMC-Fe具有优异的尺寸排阻效应和糖基富集性能。透射电子显微镜（TEM）图像显示MMC-Fe中分散的γ-Fe₂O₃纳米颗粒，赋予其磁性。氮气吸附-脱附等温线和孔径分布曲线表明MMC-Fe具有均匀的介孔结构，孔径约为4.0nm，有利于基于尺寸排阻效应捕获N-糖基并避免蛋白质干扰。

图2. (a)健康对照、肝硬化和肝癌三个队列的样本规模、性别分布和年龄分布。(b)用MMC-Fe测定三组血清消化物n-聚糖的典型质谱图。(c)血清n-聚糖的OPLS-DA评分图和(d)对应的200种排列对健康对照和肝硬化/肝癌的区分。

N-糖基的富集与检测：以卵清蛋白（OVA）消化产物为标准样品，评估了MMC-Fe对N-糖基的富集能力。结果表明，即使在OVA浓度低至1ng/μL时，MMC-Fe仍能捕获一定量的N-糖基。此外，MMC-Fe在存在大量大分子蛋白质的生物样品中，能够有效排除高丰度蛋白质的干扰，选择性地捕获小分子N-糖基。将MMC-Fe应用于57份血清样品（包括健康对照组、肝硬化患者和肝癌患者）的N-糖基分析，通过MALDI-TOFMS获得了22个N-糖基特征峰。利用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型，成功区分了健康对照组与肝硬化和肝癌患者，模型的拟合度通过200次置换验证，显示出高可靠性和有效性。

图3. 根据(a)健康对照/肝硬化、(b)健康对照/肝癌和(c)肝硬化和肝癌中选择的n-聚糖绘制受试者工作特征（ROC）曲线。基于(d)健康对照/肝硬化和(e)健康对照/肝癌选定n-聚糖的热图。

关键N-糖基的筛选与评估：基于OPLS-DA模型中的变量重要性投影（VIP）、P值和倍数变化（FC）三个重要系数，分别从健康对照组/肝硬化和健康对照组/肝癌两组比较中筛选出7个具有显著差异的N-糖基。这些N-糖基在肝硬化和肝癌检测中表现出卓越的性能，AUC值分别为0.993和0.963。值得注意的是，在本研究中，71.4%的肝癌样本（15例）AFP检测呈阴性，而所选的7个N-糖基仍能成功区分AFP阴性肝癌样本与健康对照样本（AUC=0.948）。此外，健康对照组/肝硬化和健康对照组/肝癌组之间有5个重叠的N-糖基，它们在区分肝硬化和肝癌方面也显示出潜力，AUC值为0.827-0.842。这些结果表明，所选的N-糖基在监测肝硬化与AFP阴性肝癌之间的进展方面具有巨大潜力。

本研究成功合成了一种基于EISA策略的磁性介孔碳材料MMC-Fe，其高产率和低时间成本使其适用于大规模样品处理。MMC-Fe与MALDI-TOFMS结合，通过机器学习模型，为精准监测肝脏疾病提供了一种高效、准确的解决方案。所筛选的关键N-糖基在区分健康对照组与肝硬化、肝癌（包括AFP阴性肝癌）患者方面表现出色，为肝脏疾病的早期诊断和精准医疗提供了有力支持。未来，结合蛋白质组学等多组学技术和更大规模的样本试验，有望发现更全面、可靠的生物标志物，进一步推动疾病监测和诊断技术的发展。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cclet.2024.109813