贝类中甲肝病毒和戊肝病毒的多重RT-ddPCR检测技术研究

在当今全球化的食品市场中，食品安全问题一直是公众关注的焦点。尤其是食品中的病毒污染，更是对人类健康构成了严重威胁。近期，一项新的研究成果为食品安全检测带来了重大突破，研究人员开发出一种多重逆转录数字PCR（RT-ddPCR）技术，能够同时检测贝类中的甲型肝炎病毒（HAV）和戊型肝炎病毒（HEV），为食品卫生监管提供了有力的技术支持。

病毒污染的严峻挑战

随着生活水平的提高，人们对海鲜产品的需求不断增加。然而，海鲜在生产、加工和处理过程中容易受到病原体的污染，成为食源性病原体传播的重要载体。据估计，全球每年发生约6亿例食源性疾病，导致42万人死亡。其中，贝类作为一类高营养价值的海鲜产品，因其在摄食过程中会从水体中积累病原体，常常携带HAV、HEV和诺罗病毒等病毒，消费者食用未经充分烹饪的贝类产品后，就有感染这些病毒的风险。

HAV和HEV是全球范围内引发肝炎感染的主要病毒，它们通过粪口途径传播，且在卫生条件较差、经济欠发达的地区发病率较高。这两种病毒可导致急性肝炎，出现发热、食欲不振、腹泻等症状，严重时甚至会危及生命。特别是在孕妇、老年人和患有基础肝病的特殊人群中，感染HAV或HEV可能导致更严重的疾病，如急性肝衰竭，给母婴健康带来巨大威胁。

现有检测方法的局限性

目前，检测食源性病毒的方法主要有逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、逆转录定量PCR（RT-qPCR）等。然而，这些方法存在一定的局限性。例如，RT-qPCR的检测效果容易受到样品中抑制物质的影响，需要进行标准曲线校准，且对低浓度病毒的检测灵敏度有限。在贝类样品中，HAV和HEV的病毒载量通常较低，而且贝类所处的海水和泥沙等环境介质成分复杂，可能会干扰检测过程，这就使得准确检测这些病毒变得更加困难。

多重RT-ddPCR技术的创新

为了克服现有检测方法的不足，研究人员开发了一种基于MS2噬菌体作为过程控制病毒（PCV）的多重RT-ddPCR技术。ddPCR作为一种第三代PCR技术，无需标准曲线即可实现对核酸的绝对定量。它通过将样品随机分配到数万个油包水的微滴中，经过PCR扩增后，利用微滴读取器对微滴进行分析，从而实现对目标基因的绝对定量。与qPCR相比，ddPCR对PCR抑制剂的耐受性更强，对低浓度核酸的定量重复性更好。

在本研究中，研究人员优化了多重RT-ddPCR的反应体系和程序。他们选择了最佳的引物和探针浓度，确定了最佳的退火温度、延伸时间和循环次数。通过单变量法优化实验条件，最终确定了在引物浓度为900 nmol/L、HAV和HEV的探针浓度为350 nmol/L、MS2的探针浓度为500 nmol/L、退火温度为53.1℃、延伸时间为90秒、循环次数为45次时，RT-ddPCR反应具有最佳的扩增效率和分离效果。此外，该技术还表现出高特异性，HAV、HEV和MS2噬菌体的定量下限分别为12.6、8.9和7.8拷贝/反应。

图1 多重逆转录 - 微滴数字 PCR（RT-ddPCR）检测方法的特异性和线性范围。（A-1）FAM 通道特异性检测。（A-2）VIC 通道特异性检测。1：双蒸水（-）；2：诺如病毒 GI 型（-）；3：诺如病毒 GII 型（-）；4：人星状病毒（-）；5：札幌病毒（-）；6：副溶血性弧菌（-）；7：金黄色葡萄球菌（-）；8：大肠杆菌（-）；9：沙门氏菌（-）；10：戊型肝炎病毒（+）、甲型肝炎病毒（-）、MS2 噬菌体（-）；11：甲型肝炎病毒（+）、戊型肝炎病毒（-）、MS2 噬菌体（-）；12：MS2 噬菌体（+）、戊型肝炎病毒（-）、甲型肝炎病毒（-）；13：戊型肝炎病毒（+）、MS2 噬菌体（+）、甲型肝炎病毒（-）；14：甲型肝炎病毒（+）、MS2 噬菌体（+）、戊型肝炎病毒（-）；15：MS2 噬菌体（+）、戊型肝炎病毒（+）、甲型肝炎病毒（+）。（+：检测到；-：未检测到）。（B-1、B-2、B-3）多重 RT-ddPCR 对甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒和 MS2 噬菌体 RNA 的定量检测线性范围。

样本检测与结果分析

研究人员对240份贝类样本进行了检测，其中4份样本HAV阳性，12份样本HEV阳性。HAV的病毒载量范围为3048至6528拷贝/2克，HEV的病毒载量范围为3312至20350拷贝/2克。通过与单重RT-ddPCR检测结果对比，多重RT-ddPCR检测与单重RT-ddPCR检测结果具有高度一致性（HAV：kappa=1.000，HEV：kappa=0.882），显示出良好的一致性，表明该多重RT-ddPCR技术在检测HAV和HEV方面具有与单重RT-ddPCR相当的性能。

表1 多重 RT-ddPCR 检测中甲型肝炎病毒（HAV）、戊型肝炎病毒（HEV）和 MS2 噬菌体的重复检测结果（n=10）。

病毒核酸富集方法的优化

为了提高贝类样本中病毒核酸的检测效率，研究人员还比较了三种不同的病毒核酸富集方法。结果显示，蛋白酶K+Trizol/氯仿法在富集MS2噬菌体时具有更高的回收率，且操作时间较短、稳定性好。因此，该方法被选为贝类样本的预处理富集方法。这一优化的富集策略不仅缩短了检测时间，还提高了病毒核酸的回收率，为检测低病毒载量的样本提供了有力支持。

图3 3种不同处理方法的结果比较（(n=6)。注：*(p<0.01)；**(p<0.001)；ns：(p>0.05)）。

结论与展望

这项研究成功开发了一种高效、灵敏的多重RT-ddPCR技术，能够同时检测贝类中的HAV和HEV。该技术具有高特异性、高灵敏度和良好的重复性，为食品安全监测提供了一种新的有力工具。通过优化病毒核酸富集方法，进一步提高了检测效率和准确性。未来，研究人员计划扩大样本量，增加样本多样性，涵盖水果、蔬菜和废水等多种基质，深入分析阳性样本的来源、类型和采集时间，以更好地了解病毒在不同环境中的传播方式。此外，监测不同季节和地区的样本，有助于揭示潜在的流行趋势，为评估食源性病毒对公共卫生的风险提供更准确的依据。这一技术的应用有望在食品安全领域发挥重要作用，为监管机构实施精准控制和及时阻断问题食品的流通提供技术支持，从而降低食源性病毒引发的公共卫生事件风险。

参考文献：

Wei M, Wang J, Wang Y, et al. Development and Application of a Multiplex Reverse Transcription–Droplet Digital PCR Assay for Simultaneous Detection of Hepatitis A Virus and Hepatitis E Virus in Bivalve Shellfish[J]. Foods, 2024, 14(1): 2.