硝基还原酶（NTR）是 FMN 依赖型酶，广泛存在于多种细菌中，包括肠球菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯菌等 ESKAPE 病原菌，这类病原菌因耐药性常引发危及生命的医院感染。NTR 在含硝基药物（如氯霉素、甲硝唑等）的胞内还原中起关键作用，而细菌 NTR 基因变异会降低对 5 - 硝基咪唑类药物的敏感性，增加治疗难度，因此明确 NTR 表达和生物活性对药物敏感性检测至关重要。荧光探针是研究 NTR 活性的有效工具，尽管已有探针用于肿瘤缺氧环境中的 NTR 检测，但近年研究者逐渐将焦点转向微生物 NTR 活性检测，以开发新型抗菌策略并深入理解病原菌致病机制。此前研究中基于查尔酮的荧光探针虽能选择性检测细菌 NTR，但因发射波长较短不适用于临床，因此需开发长波长、高灵敏度的新型探针用于微生物 NTR 检测。

探针 IND-NO₂基于吲哚荧光团（IND-OH）与 4 - 硝基苯通过酯键连接合成，本身因供体 - 受体结构断裂而无荧光。在大肠杆菌 NTR（EcNfsB）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）存在下，探针的硝基被还原为氨基，生成荧光产物 IND-OH，在 564 nm 处荧光显著增强，荧光量子产率从 0.03 提升至 0.28，溶液颜色从黄色变为粉红色，可通过肉眼观察。研究通过荧光光谱和高效液相色谱（HPLC）分析证实了产物 IND-OH 的生成，测得该探针对 EcNfsB 的检测限为 6.21 nM（0.16 μg/mL），低于其他已报道的大肠杆菌 NTR 探针。动力学参数显示，探针还原的表观米氏常数（Kₘ）为 8.3 μM，催化常数（kₙₐₜ）为 0.0256 s⁻¹。

图 1：展示探针 IND-NO₂被细菌 NTR 还原生成荧光产物 IND-OH 的整体概念及反应机制。 

图 2：不同溶剂中 IND-NO₂和 IND-OH 的吸收光谱与荧光光谱，显示 IND-OH 在长波长处有强荧光发射。

特异性实验表明，探针仅在 NTR 催化下被还原，与葡萄糖、维生素 C、谷胱甘肽（GSH）、牛血清白蛋白（BSA）等多种生物分子共孵育后无荧光信号激活，加入 NTR 抑制剂双香豆素后荧光信号完全抑制。将探针用于检测大肠杆菌 TISTR780、铜绿假单胞菌 TISTR781、金黄色葡萄球菌 TISTR1466 的 NTR 活性，荧光光谱显示处理后的细菌样本荧光强度显著高于未处理对照组，且抑制剂存在时信号明显降低。共聚焦显微镜成像显示，接触探针的细菌发出绿色荧光（IND-OH 信号），而经抑制剂预处理的细菌无荧光，表明探针可穿透细胞膜响应胞内 NTR 活性，且产物 IND-OH 可释放至胞外，检测无需复杂前处理。

图 3：HPLC 分析证实 IND-NO₂经 EcNfsB 催化生成 IND-OH，通过保留时间验证产物一致性。 

图 4：（A）荧光光谱法测定探针检测限为 6.21 nM；（B）米氏动力学曲线显示探针与 EcNfsB 的催化参数。 

图 5：荧光实验表明仅 NTR 催化反应激活荧光信号，抑制剂双香豆素可抑制信号。

该探针为检测 ESKAPE 病原体感染提供了潜在工具，其长波长发射（564 nm）减少了背景干扰，高灵敏度、特异性及肉眼可见的颜色变化使其在实际应用中具有优势，有望用于细菌感染的实时检测、抗菌策略开发及抗生素敏感性评估。探针合成步骤简单（两步反应，产率 55%-72%），易于规模化生产，具有从实验室向临床转化的潜力。

参考文献：Kamthong T, Khaikate O, Naradun N, et al. Nitroreductase-Activated Fluorescence Probe for Detection of Bacterial Infections[J]. ACS Omega, 2025.