摘要

神经病理性疼痛以特定伤害感受器群体的异常活动为特征，这一特征通过微神经描记术等功能评估手段得以证实。目前针对严重神经病理性疼痛的治疗方法效果不足，且常引发不良副作用，原因在于这些方法未能特异性地靶向受累的伤害感受器。能够在体外复现微神经描记术某些方面的工具，将有助于实现更具针对性的化合物筛选。因此，我们开发了一种体外平台，该平台结合了基于互补金属氧化物半导体（CMOS）的高密度微电极阵列和聚二甲基硅氧烷（PDMS）引导微结构，能够捕捉单个轴突的电生理响应。人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的感觉神经元以一种方式培养，使得轴突能够通过平行的 4×10 微米微通道从播种孔延伸出来，然后汇聚到一个更大的轴突收集通道。这种配置使得能够测量单个轴突的刺激诱导响应。感觉神经元展现出极为丰富的电生理响应特征，可被分类为不同的功能原型。此外，我们还发现，应用 TRPV1 激动剂辣椒素会影响部分响应。总体而言，使用我们的平台所得到的结果表明，我们能够区分单个轴突的响应，这使得该平台成为测试针对特定感觉神经元亚型的治疗候选药物的有前途的工具。

结果与讨论

平台设计与功能验证

研究人员设计的体外平台，通过 PDMS 微结构引导人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生感觉神经元的轴突生长，使其穿过平行的 4×10 微米微通道，最终汇聚到较大的轴突收集通道。这种独特的网络配置，使得单个轴突的刺激诱导响应得以精准测量。实验中，感觉神经元展现出极为丰富的电生理响应特征，可被分类为不同的功能原型。此外，研究人员还发现，应用 TRPV1 激动剂辣椒素会影响部分响应，为研究伤害感受器的药物敏感性提供了可能。

图 1：体外平台示意图

 轴突引导结构设计

该平台的 PDMS 微结构设计巧妙，包含一个中央播种孔和两个侧孔。中央播种孔内为 hiPSC 衍生感觉神经元，从该孔延伸出的微通道在两侧各有八条，通道末端变窄至约 3 微米，以减少轴突回退生长的可能性。随后，轴突汇聚到较宽的通道中，该通道末端变窄，以便限制更多轴突，提高刺激效率。微通道的狭窄尺寸对于放大通常低幅度的轴突细胞外信号至关重要。此外，沿轴突收集通道设计的孔洞作为扩散孔，有助于营养物质、生长因子、氧气以及药物筛选中添加化合物的扩散。在播种后 20 天内，神经球体通过 16 条微通道延伸轴突，并向轴突收集通道末端生长。通过在轴突收集通道的两端施加不同刺激电压和频率的电刺激，并在对应的 8 条微通道内记录相应的尖峰信号，研究人员能够独立地测量每个网络的响应。该平台支持在单个高密度微电极阵列上进行多达十个独立网络的电生理分析，提高了实验通量，并增强了延迟测量的统计可靠性。

 刺激电压与频率对轴突传导的影响

在研究中，研究人员发现，随着刺激电压的增加，诱发的动作电位数量逐渐增多，直至在 800 毫伏时达到约 20 个的平台期。这表明，随着刺激电压的升高，轴突收集通道内被招募的轴突数量逐渐增加。然而，当刺激电压低于 600 毫伏时，较早出现传导失败，而 700 毫伏的刺激电压足以在整个刺激期间维持响应。但有趣的是，随着刺激电压幅度的进一步增加，传导失败的点又趋于减少。研究人员推测，这可能是由于较高电压幅度招募了较细的轴突，而这些轴突对应的亚型倾向于较早出现传导失败。此外，研究人员还观察到，随着刺激频率的增加，轴突的传导特性表现出频率依赖性调制。在重复刺激过程中，轴突倾向于逐渐减缓后续动作电位的传导速度，且在较高刺激频率下，传导延迟的增加更为显著。这种频率依赖性调制从 4 赫兹的刺激频率开始变得明显。这一发现与体内微神经描记术和单纤维记录研究的结果一致，表明该体外平台能够模拟体内伤害感受器的活动依赖性减缓（ADS）特性。

 轴突电生理响应的聚类分析

为了探究不同轴突亚型的电生理特征，研究人员对 320 条微通道的电生理响应进行了聚类分析。通过主成分分析（PCA）和 K 均值聚类算法，研究人员成功将轴突分为三个不同的簇。这些簇在传导速度、相对减缓、传导失败、负峰和正峰幅度变化等指标上表现出显著差异。例如，蓝色簇的轴突在整个刺激期间表现出持续的响应，具有较低的 ADS 和变化多端的峰幅度变化；而绿色和紫色簇的轴突则表现出较早的传导失败，且初始延迟较长，暗示其基线传导速度较慢。这些结果表明，该平台能够根据电生理响应特征区分不同的轴突亚型，为未来基于功能特征的伤害感受器亚型分类提供了可能。

 辣椒素对轴突响应的影响

研究人员还探讨了 TRPV1 通道激动剂辣椒素对轴突响应的影响。实验中，研究人员观察到，在同一微通道内的轴突对辣椒素的反应存在差异。在某一微通道中，基线时记录到三个不同的轴突响应：两个响应在整个刺激期间持续存在，而最后一个响应表现出早期传导失败。在添加辣椒素后，延迟最晚的响应（橙色箭头）显示出与基线不同的行为，而其他两个响应则保持与基线相似的模式。具体来说，最初表现出传导失败的轴突在辣椒素暴露后显示出更一致的激活。在超过 100 纳摩尔的辣椒素浓度下，该轴突展现出更易变的响应模式。这种转变可能反映了已知的辣椒素诱导的脱敏现象，但需要进一步研究来证实这一解释。此外，该轴突在辣椒素洗脱后的响应并未恢复到初始状态，这可能表明存在长期脱敏效应，或者是由于 PDMS 微结构的扩散孔限制了辣椒素的扩散。而两个传导速度较快的响应在整个实验条件下均未改变。这些初步结果表明，该平台可能能够检测到对辣椒素刺激的差异性响应，尽管需要更大的样本量和分子特征验证来进一步确认。

结论与展望

本研究开发的体外平台在高密度 CMOS 微电极阵列上实现了对人诱导多能干细胞衍生伤害感受器的电生理响应特征的精准测量。通过 PDMS 轴突引导微结构，研究人员能够独立测量刺激诱导的轴突响应，并利用这些响应特征区分伤害感受器亚型。未来的研究将通过与遗传表达特征的验证，将这些功能响应特征确立为独立的生物标志物，以区分伤害感受器亚型。此外，该平台还展示了在药物筛选方面的潜力，尤其是在与自动化培养基交换系统结合时，有望创建高度可重复的、细胞亚型特异性的剂量 - 反应曲线。总之，本研究中观察到的广泛的电生理响应多样性，突显了开发能够在单个轴突水平上提供高分辨率读出的新体外方法的必要性，以便为特定伤害感受器亚型的药物发现过程提供支持。该平台还有望应用于其他神经药物研究领域，这些领域目前使用的药物成功率和特异性较低。