侧向层析免疫分析（LFA）因其操作简便、快速和便携性而被广泛应用于临床诊断、环境监测和食品安全等领域。然而，传统的小分子LFA通常输出“信号关闭”模式，即分析物浓度与信号强度成反比，这种模式由于背景信号高，不利于肉眼定性检测。为解决这一问题，荧光信号“开启”LFA（FONLFA）被提出，其中分析物浓度与荧光信号强度成正比。FONLFA具有背景信号低、灵敏度高的优点。目前，FONLFA中常用的荧光猝灭剂包括金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）和聚多巴胺纳米球（PDANs），而荧光供体主要包括量子点、荧光素和聚集诱导发光微球（AIEFMs）。然而，这些材料在荧光纳米材料固定化和选择合适的荧光猝灭剂方面仍存在挑战。金属纳米簇（MNCs）因其简单的合成过程、大的斯托克斯位移、可调的多色荧光和良好的生物相容性而被广泛应用于生物传感和成像。

本研究中，作者通过简单的混合方法制备了亮荧光金属纳米簇（Prot-AuNCs），并将其与三种典型小分子抗原自组装成Prot-AuNCs/抗原聚集体，用于FONLFA的开发。这种聚集体可以轻易地固定在硝酸纤维素（NC）膜上，简化了检测条的制备过程。通过比较四种典型的纳米材料作为比色纳米探针和荧光猝灭剂，作者发现Fe-聚多巴胺纳米颗粒（FePNs）在FONLFA中表现出最佳的猝灭效果。

示意图1. (A) Prot-AuNCs制备示意图；(B)荧光信号“开启”侧流免疫法（FONLFA）荧光材料固定在硝化纤维素膜上的常规碳二亚胺法与本研究中采用自组装策略固定Prot-AuNCs/多菌灵-牛血清白蛋白（CAR-BSA）或BSA的效率比较；(C) FONLFA中AuNPs、聚多巴胺纳米球、Au@PDANs和Fe-聚多巴胺纳米粒子（FePNs）荧光猝灭能力的比较；(D) FONLFA中的CAR检测原理；(E) AuNPs-LFA与FePNs-FONLFA的肉眼检出限比较。

研究内容

图1. Prot-AuNCs的表征

Prot-AuNCs的制备与表征：通过将Prot引入ATT-AuNCs溶液中，一步合成了Prot-AuNCs。实验发现，当Prot浓度约为15 µM时，Prot-AuNCs具有最佳的单分散性和亮度。Prot-AuNCs的量子产率（QY）从ATT-AuNCs的1.8%提高到4.3%，且在连续紫外照射下具有更低的光致发光漂白。通过X射线光电子能谱（XPS）和透射电子显微镜（TEM）等表征手段，确认了Prot-AuNCs的成功制备。

图2. 制备的AuNCs/多菌灵-牛血清白蛋白（CAR-BSA）的表征。

图3. Prot-AuNCs/抗原自组装的表征

Prot-AuNCs/抗原自组装的表征：Prot-AuNCs与BSA或CAR-BSA混合后，自组装形成AuNCs/CAR-BSA和AuNCs/BSA聚集体。TEM和动态光散射（DLS）结果显示，这些聚集体具有较大的尺寸和良好的分散性。通过元素映射和电位测量，证实了聚集体的组成和稳定性。

图4. 自组装AuNCs/抗原在NC膜上固定化的评价

自组装AuNCs/抗原在NC膜上的固定化：AuNCs/CAR-BSA聚集体通过简单的喷雾方法固定在NC膜上，形成强荧光线。与化学共轭方法相比，自组装策略显著提高了固定效率，减少了操作步骤，并避免了表面修饰可能对纳米簇造成的损伤。

图5. 四种纳米探针对AuNCs的猝灭

四种纳米探针对AuNCs的猝灭效果：比较了AuNPs、PDANs、Au@PDANs和FePNs四种纳米材料作为猝灭剂的效果。FePNs因其宽吸收带和强肩峰，在荧光猝灭效率上表现最佳，使AuNCs/CAR-BSA的荧光猝灭率达到85%。

图6. 在CAR检测中的应用

FONLFA在CAR检测中的应用：通过优化Prot-AuNCs在T线和C线的喷雾量、四种纳米探针的用量、CAR-BSA的浓度和免疫反应时间，实现了对CAR的超灵敏检测。FePNs-FONLFA在荧光“开启”模式下的视觉检测限（vLOD）比传统比色AuNPs-LFA低200倍，定量分析中的检测限（LOD）降低了22倍。在实际苹果样本的检测中，FePNs-FONLFA显示出良好的准确性和选择性。

本文提出了一种基于ProtAuNCs和抗原之间强相互作用的新型自组装策略，用于在NC膜上共固定抗原和AuNCs。这种策略极大地简化了FONLFA的构建过程。通过选择Prot-AuNCs作为荧光供体和FePNs作为荧光猝灭剂，开发了一种超灵敏的FONLFA用于检测苯并咪唑类农药CAR。FePNs-FONLFA在荧光“开启”模式下的vLOD比传统比色AuNPs-LFA降低了200倍，定量分析中的LOD降低了22倍。该方法在食品安全、环境监测和临床诊断等领域具有广阔的应用前景。

原文链接：https://doi.org/10.1002/agt2.644