细菌耐药性（AMR）已成为21世纪重大公共卫生问题。2019年，全球因细菌抗菌药物耐药性（AMR）导致127万人死亡，预计至2050年，AMR每年可能造成1000万人死亡，或成为全球主要死因。应对这一危机需多维度策略，包括开发新抗生素、合理使用现有药物、解析耐药机制及改进诊断技术。然而，临床中在AST结果明确前经验性使用抗生素，进一步加剧了AMR。延迟启动有效抗生素治疗会显著增加发病率、死亡率及经济成本。例如，菌血症患者每延迟1小时使用正确抗生素，死亡风险增加9%。因此，临床迫切需要能在30分钟至1小时内出具结果的快速AST平台，这不仅可优化感染性疾病管理，还能通过助力临床试验降低新药开发成本。当前临床常用的自动化细菌生长检测仪器（如Vitek 2、BD）需4-18小时出具AST结果，而传统基于生长的方法从临床样本到获得药敏结果至少需2天，包括初始培养、分离和富集等步骤。基因型AST虽快（1-5小时），但无法提供MIC等定量药敏指标，且检测范围受已知耐药决定因子限制。表型AST中，依赖细胞生长响应的方法存在时间瓶颈，非生长型新技术（如AFM振动技术、阻抗）虽展现潜力，但尚未形成普适性方案。在此背景下，开发兼具快速、定量、广谱特性的新型AST技术具有重要科学价值与临床意义。

为此，本研究开发了一种基于SERS的超快速AST方法，其反应原理可概括为：通过检测细菌在抗生素处理后分泌的嘌呤代谢物（如腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤）的变化，利用SERS技术快速、定量地评估细菌的代谢响应。具体来说，细菌经30分钟抗生素孵育后，水洗会引发其严谨反应（SR），（p）ppGpp警报素介导tRNA和rRNA降解为嘌呤代谢物并分泌；抗生素暴露通过次级代谢效应改变这一过程，使嘌呤分泌量随抗生素浓度呈剂量依赖性变化。敏感菌的代谢活动被抗生素抑制，导致嘌呤分泌量减少，SERS信号强度显著降低；而耐药菌的代谢活动未被显著抑制，嘌呤分泌量变化不大，SERS信号强度基本保持稳定。通过将细菌的SERS光谱与已知的嘌呤标准光谱进行拟合分析，可以确定细菌光谱中各嘌呤成分的相对含量。再依据光谱强度降至最大值的18%时对应的抗生素浓度，以此来确定MIC值。

作为例证，作者展示了13种细菌-抗生素组合的SERS-AST测试结果，这些组合涵盖了革兰氏阳性和阴性菌以及多种常见的抗生素，包括：大肠杆菌（E. coli）、屎肠球菌（E. faecium）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、屎肠球菌（E. faecium）、腐生葡萄球菌（S. saprophyticus）和雷极普罗威登斯菌（P. rettgeri）及美罗培南、左氧氟沙星、氨苄西林、四环素、万古霉素、氯霉素、妥布霉素、克林霉素和硝基呋喃妥因。结果显示，SERS-AST测定的MIC与传统方法高度一致，仅雷极普罗威登斯菌2525/美罗培南组相差1个浓度梯度，符合可接受范围。敏感菌株的SERS强度随抗生素浓度升高显著下降，如肺炎克雷伯菌1898对四环素，在MIC处强度降至≤18%最大值。耐药菌株如肺炎克雷伯菌6908对氨苄西林、屎肠球菌700221对万古霉素，其SERS强度不随浓度变化（图1）。从分子层面看，这些SERS信号的变化源于细菌分泌的嘌呤类代谢物的差异。如图2所示，通过对大肠杆菌2452、屎肠球菌2127、腐生葡萄球菌10320、肺炎克雷伯菌1898等菌株在无抗生素条件下的SERS光谱拟合分析，证明细菌的785 nm SERS信号主要由嘌呤类核酸降解代谢物（如腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷等）主导，不同菌株的嘌呤组成存在显著差异——例如屎肠球菌2127的SERS光谱中腺嘌呤占比达90%，而大肠杆菌2452则以腺嘌呤（约60%）、黄嘌呤（约20%）和鸟苷（约20%）为主，这为SERS信号的特异性和菌株区分提供了分子基础。进一步，作者以六种代表性细菌-抗生素组合为例，展示嘌呤组分的相对贡献随抗生素浓度的变化规律，从而揭示SERS强度变化的分子机制。对于敏感菌株（如肺炎克雷伯菌1898与四环素、大肠杆菌2452与四环素），嘌呤组分（如次黄嘌呤、腺嘌呤）的相对占比随抗生素浓度呈系统性调整，在MIC处出现明显转折；而耐药菌株（如肺炎克雷伯菌6908与氨苄西林、屎肠球菌700221与万古霉素）的嘌呤组分相对稳定，不受浓度影响。这说明SERS强度的剂量依赖性变化本质上是嘌呤代谢受抗生素扰动的结果，支持了SERS-AST通过光谱强度评估药敏性的原理（图3）。

总的来说，研究基于“细菌在30分钟孵育期内对特定抗生素产生代谢途径的快速重编程，当随后触发饥饿状态时，这种重编程会改变严谨反应的结果，进而影响降解RNA产生的嘌呤分泌水平。耐药菌株的这种下游次级核苷酸降解反应则未受干扰”反应原理，根据临床客观需求，发展了迄今为止最快的表型方案。该方法对革兰氏阳性/阴性菌、不同作用靶标的抗生素（杀菌/抑菌）均有效，结果与传统方法高度一致，揭示了抗生素通过干扰次级代谢影响嘌呤分泌的机制，为快速指导精准用药、减少耐药性提供了关键技术支撑。

图1  13组代表性菌株-抗生素组合的SERS-AST结果。每组条形图展示了不同抗生素浓度下的归一化SERS峰值强度（深蓝色）和积分面积（浅蓝色），误差线代表三次独立实验的标准偏差。绿色虚线箭头指示通过24小时肉汤稀释法测定的MIC，红色实线箭头指示SERS-AST判定的MIC。

图2  通过线性组合嘌呤（腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤）的SERS光谱对四种代表性细菌的归一化观测SERS光谱（黑色）进行最佳拟合（红色）。

图3  六种代表性细菌菌株/抗生素组合的归一化785 nm SERS中嘌呤组分的剂量依赖性。对于对指定药物敏感的四种细菌菌株，表面增强拉曼光谱测定的最低抑菌浓度值为红色标注的抗生素浓度；肺炎克雷伯菌6908和屎肠球菌700221分别对氨苄西林和万古霉素具有耐药性。

原文链接：ttps://doi.org/10.1016/j.talanta.2025.127907