在食品安全领域，蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）一直是一个令人头疼的问题。这种广泛存在于自然界的细菌能够污染各种食物，引发食源性疾病，给食品行业带来巨大损失。然而，由于蜡样芽孢杆菌与其他近缘种在基因上高度相似，传统的检测方法难以快速、准确地将其与其他近缘种区分开来，这给食品安全监管带来了巨大挑战。但最近，一项发表在《International Journal of Food Microbiology》杂志上的新研究，为我们带来了曙光。

研究背景：蜡样芽孢杆菌的威胁与检测困境

蜡样芽孢杆菌复合群（Bacillus cereus sensu lato，简称 B. cereus s.l.）包含多个物种，它们在进化关系上紧密相连，但在致病性上却存在显著差异。其中，蜡样芽孢杆菌是重要的食源性病原菌，能够引起呕吐、严重腹泻，甚至死亡。此外，该复合群中的其他成员，如苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌呕吐毒素型、炭疽芽孢杆菌等，也具有潜在的致病风险。例如，苏云金芽孢杆菌是一种广泛使用的生物杀虫剂，但其残留物可能引发人类腹泻综合征。

在食品工业中，蜡样芽孢杆菌的污染问题尤为突出。它能够污染大米及其制品、香料、新鲜蔬菜和巴氏杀菌牛奶等多种常见食品。研究表明，某些蜡样芽孢杆菌菌株在食物中的毒素基因携带率很高，这进一步加剧了食源性疾病的风险。然而，目前的检测标准和方法在面对这一复杂菌群时显得力不从心。传统的基于培养的方法虽然在特定条件下具有高灵敏度，但操作复杂、耗时费力。而现有的分子诊断工具，由于蜡样芽孢杆菌复合群成员之间的基因高度相似，也难以实现准确的物种鉴定。

创新方法：基于全基因组切片的比较分析与CRISPR/Cas12a检测

为了解决这一难题，研究人员开发了一种名为“基于全基因组切片的比较分析（Comparative Analysis based on Whole Genome Slices，简称 CAWGS）”的新方法，并将其与Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）相结合，用于挖掘物种特异性的分子靶标。通过这种方法，研究人员成功地为蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、呕吐毒素型蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌肌样型、魏氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌等七个物种找到了新的分子靶标。

基于这些新发现的分子靶标，研究人员进一步开发了一种PCR-CRISPR/Cas12a检测方法，用于快速、准确地检测蜡样芽孢杆菌复合群及其相关物种。CRISPR/Cas12a系统是一种基于CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）的基因编辑工具，具有高特异性、快速和易于使用的特点。近年来，该系统已被广泛应用于分子诊断领域，并在单核苷酸多态性（SNP）水平上展现出了卓越的区分能力。

图1 蜡样芽孢杆菌群及相关物种精准鉴定的示意图。（A）分子靶标识别过程概述。（B）使用CRISPR/Cas12a对蜡样芽孢杆菌群及相关物种进行精准的物种区分。（C）CAWGS-BLASTN的工作流程。

研究结果

研究人员通过一系列实验验证了新方法的有效性。他们首先对21株不同细菌进行了特异性验证，包括9种蜡样芽孢杆菌复合群成员和12种其他食源性病原菌。结果表明，新开发的PCR-CRISPR/Cas12a方法能够准确地将蜡样芽孢杆菌复合群中的各个物种与其他细菌区分开来。

图2 PCR-CRISPR/Cas12a对蜡样芽孢杆菌群六个成员和巨大芽孢杆菌的特异性分析。（A）使用NC2靶标检测蜡样芽孢杆菌。（B）使用ANN靶标检测苏云金芽孢杆菌。（C）使用NC3靶标检测呕吐型蜡样芽孢杆菌。（D）使用group_4502靶标检测蕈状芽孢杆菌。（E）使用gabR靶标检测魏氏芽孢杆菌。（F）使用yloA靶标检测巨大芽孢杆菌。（G）使用group_8862靶标检测炭疽芽孢杆菌。

 此外，研究人员还对混合样本进行了检测，模拟了实际食品样本中可能存在的复杂情况。实验结果表明，即使在混合样本中，该方法也能够成功地检测出目标物种，且不受其他细菌的干扰。

图3 PCR-CRISPR/Cas12a在混合样本中检测蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的特异性。（A）和（B）使用NC2靶标对混合及纯培养样本进行PCR检测。样本1，蜡样芽孢杆菌；样本3，苏云金芽孢杆菌；样本4，呕吐型蜡样芽孢杆菌；样本5，太平洋芽孢杆菌；样本6，类炭疽芽孢杆菌；样本7，蕈状芽孢杆菌；样本8，魏氏芽孢杆菌；C，阴性对照。（C）和（D）使用ANN靶标对混合及纯培养样本进行PCR检测。样本1，七种芽孢杆菌的混合样本；样本2，魏氏芽孢杆菌；C，阴性对照。

 在灵敏度测试方面，研究人员对纯培养的细菌进行了不同浓度的检测。结果显示，该方法对蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、呕吐毒素型蜡样芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌肌样型、魏氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的检测灵敏度分别达到了3.7×10³ CFU/mL、5.5×10⁰ CFU/mL、2.5×10² CFU/mL、1.6×10¹ CFU/mL、1.1×10³ CFU/mL 和 1.8×10⁰ CFU/mL。这些灵敏度水平完全符合当前食品安全标准的要求，为食品中蜡样芽孢杆菌复合群的检测提供了一个有力的工具。

图4 PCR-CRISPR/Cas12a在混合样本中检测蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的特异性。（A）和（B）使用NC2靶标对混合及纯培养样本进行PCR检测。样本1，蜡样芽孢杆菌；样本3，苏云金芽孢杆菌；样本4，呕吐型蜡样芽孢杆菌；样本5，太平洋芽孢杆菌；样本6，类炭疽芽孢杆菌；样本7，蕈状芽孢杆菌；样本8，魏氏芽孢杆菌；C，阴性对照。（C）和（D）使用ANN靶标对混合及纯培养样本进行PCR检测。样本1，七种芽孢杆菌的混合样本；样本2，魏氏芽孢杆菌；C，阴性对照。

未来展望

这项研究不仅为蜡样芽孢杆菌复合群的检测提供了一种快速、准确的新方法，而且其创新的分子靶标挖掘方法和检测系统具有广泛的适用性。研究人员指出，CAWGS-BLAST方法在分子靶标挖掘方面具有独特的优势，它能够突破传统泛基因组分析的局限，更灵活地选择分子靶标，并且能够检测到细微的序列差异，如SNP。此外，该方法还扩大了搜索范围，尤其是在非编码区域。这些特点使得CAWGS-BLAST方法在挖掘其他具有高度相似基因背景的细菌物种的分子靶标时也具有潜在的应用价值。

参考文献：

Zhao Y, Xie J, Yu S, et al. A novel method of species-specific molecular target mining and accurate discrimination of Bacillus cereus sensu lato[J]. International Journal of Food Microbiology, 2025, 431: 111068.