研究背景

在漫长的进化过程中，细胞已经进化出复杂的级联反应，例如酶水解、信号转导或转录激活，以将自然生物途径中的弱信号放大数百或数千倍。这种机制使生物体能够以高度敏感和节能的方式适应环境变化。相比之下，合成系统通常存在信号输出低和灵敏度不足的问题，主要是由于缺乏类似于自然系统中用于放大响应信号的复杂且多功能的信号放大级联。受自然信号放大的启发，研究人员尝试将生物传感电路与信号放大模块集成，以促进预测优化效果。这些工作通常涉及转录因子、RNA 聚合酶、G 蛋白偶联受体 （GPCR）和反馈回路等成分。

T7 RNA 聚合酶 （T7 RNAP） 是一种众所周知的用于核酸和基于蛋白质的回路扩增的酶。T7 溶菌酶是 T7 RNAP 的天然转录抑制剂。基于这一原理，研究人员通过蛋白酶可切割接头将 T7 溶菌酶与 T7 RNAP 融合，设计了一种蛋白酶反应性聚合酶 （PR） 级联模块。基于先前的研究，本研究通过在 PR 框架中扩展了三个共调节成分，包括 HRV 3C 蛋白酶介导的酶水解、SsrA 降解标签辅助背景控制和 IPTG 介导的信号增益调制，在大肠杆菌中开发了一种可调的两层 PAT（蛋白酶激活转录）遗传信号放大器。

研究原理

图1 用于增强全细胞生物传感器灵敏度的蛋白酶激活转录（PAT）信号放大系统的示意图

张桂敏教授团队开发的名为PAT的双层信号放大系统，核心原理图1所示，主要包括以下内容：

1、第一级放大：目标物诱导传感器表达HRV 3C蛋白酶（3Cp），3Cp切割T7 RNA聚合酶-抑制子融合蛋白（T7 RNAPi），释放活性T7 RNAP；

2、第二级放大：激活的T7 RNAP驱动T7启动子-sfGFP报告基因的高表达，实现信号指数级放大。

3、精准调控：

背景抑制：通过SsrA降解标签标记3Cp，利用ClpXP蛋白酶系统清除漏表达（图1C）。

信号增益：IPTG浓度调控LacI阻遏蛋白，动态调节T7启动子活性（图1B-C）。

研究结果

图2 PAT耦合传感器的优选背景和增益设置的识别

为了证明PAT信号放大器在优化各种传感器方面的多功能性和稳健性，我们将其集成到四个示例性生物传感电路中，并评估了它们的检测能力。这些包括上述天然汞传感电路、大肠杆菌衍生的天然砷传感电路、铜绿假单胞菌衍生的水杨酸（SA）传感电路，以及枯草芽孢杆菌衍生的对香豆酸（p-CA）传感电路。它们与PAT放大器的集成遵循与汞传感器类似的背景和增益调整过程（图2D）。如图2F和G所示，最佳的PAT-mercury传感器配置需要一个SsrA标签来抑制背景表达，需要一个0.033m MIPTG来放大信号增益。在这些条件下，剂量-时间响应分析表明，PAT放大器降低了普通汞传感器对Hg的检出限，从32nM到1nM，远低于WHO/EPA安全阈值10nM（图3A）。为了更好地比较检测性能，将不同传感器系统的8小时剂量反应数据输入到基于Hill函数的生化模型中（图3B）。在这个模型中，K_M表示导致传感器半数最大激活的诱导体浓度，与传感器灵敏度呈负相关，而K对应于最大输出表达水平，与传感器的输出幅度呈正相关。拟合结果表明，PAT放大器降低了K_M是普通汞传感器的73.3倍，k是6.9倍，证实了PAT放大汞传感器在灵敏度和信号输出方面有显着改善。

图3 PAT信号放大器优化的细胞生物传感器的表征

总结与展望

张桂敏教授团队成功地开发了一种可调谐的 PAT 信号放大器，可以很容易地应用于不同的生物传感器，并大大提高它们的信号输出和灵敏度。该系统是优化生物传感系统以满足特定应用灵敏度要求的强大工具，同时最大限度地减少传统上传感器特定优化所需的时间和资源。此外，由于 PAT 放大器中使用的组件的可塑性和多功能性，优化的 PAT 级联电路有可能转移到其他大肠杆菌菌株或其他宿主，如枯草芽孢杆菌和假单胞菌属，以在环境监测、合成生物学和其他相关领域寻求更有价值的应用。

 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117756