Food Chemistry:一种用于肉制品中同时检测单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的新型双重 qPCR-HRMA 技术
Food Chemistry:一种用于肉制品中同时检测单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的新型双重 qPCR-HRMA 技术
李斯特菌与沙门氏菌是全球食品安全的“隐形杀手”,特别对孕妇、老人和儿童等易感人群威胁巨大。每年数以万计的严重病例与死亡与其相关,且这两种细菌常见于肉类、蛋奶等动物源性食品中,食品生产与消费环节稍有不慎即可传播疾病。
过去十年中,聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 在病原检测中得到广泛应用,甚至成为多种病原检测的标准方法。实时定量 PCR (quantitative PCR, qPCR) 技术因其快速、准确等优点,被开发用于单一、双重乃至多重病原检测。但专门针对单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的双重检测方法报道较少。已有研究多将其与其他病原联合检测,但若未充分标准化,可能导致检测精度下降和检测限升高。且在监管检测中,生产商和出口商必须证明各类肉制品中这两种病原物的缺失。对于保质期仅 3–4 天的肉制品,需时 4–5 天的常规方法显然不切实际。因此,将两者检测合并可简化流程、缩短检测时间,并加快决策。此外,尽管样品中可能存在其他病原,但全球监管框架普遍优先关注单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌,因此对其快速、灵敏、联合检测的需求始终存在。
高分辨率熔解曲线分析 (High-resolution melting Analysis, HRMA) 是一种 qPCR 后的技术,可依据 DNA 熔解曲线区分不同序列。HRMA 可在不额外添加探针的情况下实现 qPCR 多重检测,避免高成本或复杂的方法,如新一代测序或数字 PCR。结合 qPCR 与 HRMA 既能实现快速高效检测,又可同时检测多种病原。近年来已有多项 qPCR‑HRMA 方法用于食品中细菌鉴定。
近日,印度国家肉类研究所S.B. Barbuddhe团队在Food Chemistry期刊上发表了题为:A novel duplex qPCR-HRMA technique for simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium in meat products的论文。
为解决上述问题,本研究创新地将 qPCR 与 HRMA 融合,省去昂贵的探针或数字 PCR 设备,仅依赖 SYBR Green 染料,即可在一管反应中实现双靶检测。通过精准调整退火温度、引物浓度与熔解速率,实验室条件下反应可在 3 小时内完成,对模拟污染样品和真实市场样品均表现出良好一致性。该方法已通过 ISO 22118 标准化流程、ISO/IEC 17025 能力验证,具备走向监管落地与临床诊断的潜力。
首先,研究人员使用Primer-AMPS对30个物种的特异性进行计算机模拟分析,证实了该序列对单核细胞增生和链球菌。鼠伤寒。此外,使用Oligocalc™和OligoAnalyst ™工具在计算机上评估了各个放大子的解链温度,揭示了其解链温度™之间存在4℃差异,LM PCR的TM为76℃,ST PCR的TM为80℃。然后使用这些经过insico验证的PCR对双链实时检测进行标准化,然后进行高分辨率解链分析。
通过毛细柱凝胶验证放大子大小。首先,通过使用毛细管电泳系统分析qPCR产物的碱基对大小来验证这两种引物的扩增产物。结果显示,主要不同的碱基对分别属于鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌(图1a)。这证实了放大的产物属于目标物种。此外,还显示了产物的绝对迁移时间(图1b)。一般来说,在凝胶系统中,较大的产物需要更长的迁移时间,因为它们的尺寸增加以及当它们移动通过毛细血管的狭窄通道时会产生更大的阻力。单核细胞增生李斯特菌的放大子具有最长的迁移时间,其次是伤寒沙门氏菌的放大子。
研究人员还注意到15-44个碱基附近的较小且微弱的条带(图1),这些条带可能是可能由非标准化检测产生的较短的PCR片段、放大子或较短的二聚体。
图1 用于验证双链qPCR-HRM检测试剂盒放大产物大小的毛细管凝胶法评价。显示了一次凝胶运行的图像(1a)和产物的绝对迁移时间(1b)。118个碱基和147个碱基的产物分别证实了鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌的存在。
研究人员接下来用单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的DNA评估引物的包含特异性,这导致LM引物扩增子的拐点约为76℃,而温度曲线图中的ST引物放大器的拐点为80℃。在差异曲线启动中也观察到了熔解曲线形状的差异,从而验证了测定的包含特异性(图2)。结果表明没有扩增交叉反应物种。因此,包容性和排他特异性都表明当前研究中LG和ST引物的高特异性。
图2温度曲线图(A)和差异曲线图(B)显示单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的单重检测和双重检测的区别。蓝色集群-鼠伤寒沙门氏菌的单纯检测(熔解温度-80 ℃);绿色集群-单核细胞增生李斯特氏菌的单纯检测(熔解温度-76 ℃);红色集群-单核细胞增生李斯特氏菌的双链检测鼠伤寒。差异可以根据温度曲线图中的拐点(如箭头所示)、差异曲线图中曲线形状的差异和集群颜色。
此外,作为涉及解链曲线分析技术的分析,研究人员还尝试优化解链速率,以提供最佳的解链分辨率用于分析。在CFX-96实时PCR设置中,熔解率由单位时间的增量(单位C)确定。提供0.05(5 s)的固定时间间隔,并通过将增量时间修改为0.2、0.5和1.0℃来优化,分别对应于0.04℃.s-1、0.1℃.s-1和0.2℃.s-1的熔解速率。
据观察,0.04℃.s-1和0.1℃.s-1都具有良好的分辨率,区分了熔解曲线分析中的两个峰,并在HRM分析的温度曲线图中提供了双拐点(图3a、b)。然而,在0.2℃.s-1时,无法获得明显的解链曲线(图3c),这表明在该解链速率下分辨率丧失。应使用足够的解链率来获得良好的分辨率,但应注意不要具有太低的解链率,因为这可能会导致相同病原体形成额外的峰,这可能是一个潜在的问题。在该例子中,与0.1℃.s-1相比,在解链曲线和HRM分析中,0.04℃.s-1足够低,可以提供良好的分辨率,具有明显的峰和更平滑的解链曲线(图3a、b)。此外,选择该熔融速率是因为在低熔融速率下,观察到具有较低标准偏差的准确Tm。
图3 在不同熔解速率下进行熔解曲线分析和高分辨率熔解分析,例如(A),熔解速率为0.04℃.s-1,(B),熔解速率为0.1℃.s-1和(C),熔解速率为0.2℃.s-1。熔解速率为(C)0.2℃.s-1时,观察到检测两种病原体的分辨率明显丧失(没有较小的峰)。两者(A)0.04℃.s-1且(B)0.1℃.s-1的熔解速率提供了良好的分辨率,具有对研究中使用的两种病原体特异性的可辨别的双峰。(A)提供了最好的分辨率,如在熔融曲线中的更平滑的熔融曲线和高分辨率熔融曲线中所看到的。
反应灵敏度由用作模板的核酸量精确定义。研究人员为每个物种的每个DNA稀释系列确定了拷贝数,其中对于20 ng至0.0002 ng的稀释度,单核细胞增生李斯特菌的拷贝数范围为3804至110个拷贝,鼠伤寒沙门氏菌的拷贝数范围为2808至56个拷贝。根据实验结果,双链qPCR-HRM检测试剂可可靠地检测到高达0.002 ng DNA(2 pg)的DNA,这被确定为检测试剂的最低限度(图4)。相应的DNA拷贝数为单核细胞增生李斯特菌124个拷贝,鼠伤寒沙门氏菌100个拷贝。
之前为在单次检测中检测单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒链球菌而开发的研究大多报告灵敏度以CFU/mL为单位,很少有研究报告以ng、PG或DNA拷贝为单位。从拷贝数来看,鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌的检测限均较低,甚至与检测链球菌的ddPCR等先进检测技术的结果相当。鼠伤寒沙门氏菌。虽然没有多少基于qPCR的研究报告了这些病原体的拷贝检测限,但值得注意的是,qPCR的检测限通常高于100个拷贝。因此,该检测试剂盒的反应灵敏度得到了验证,并发现其更好或与国际上报道的先进技术相当。
图4 用于测定反应灵敏度的高分辨率熔体分析。(A)显示红色簇中双链体检测的双拐点的归一化温度曲线图和(B)观察到熔解曲线形状和颜色差异的温度偏移差异曲线图(红色簇-具有双拐点的反应,检测单核细胞增生李斯特菌在76 ℃和鼠伤寒沙门氏菌在80℃,最多5个稀释度)。在第六个稀释系列中仅检测到(蓝色集群),表明该反应足够敏感,可以检测到第五个稀释系列之前的两种病原体。
为了验证检测现场样本中鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌的方法,对监管样本和来自其他地方的样本进行了测试,并在认可的实验室中接收用于分析。VITEK 2细菌鉴定系统和开发的检测试剂盒的结果列于表4中。
在分析的29个样本中,发现收到用于检测的两个监管样本含有单核细胞增生李斯特菌(表4)。在Thomas-qPCR HRM检测中分析了阳性样本,获得了温度曲线图中的单个拐点和与阴性/双阳性对照相比不同的簇分配。观察结果也通过TEK 2细菌鉴定系统进行了验证。收到的另外两份监管样本在TEK 2检测试剂盒和开发的检测试剂盒中发现均含有鼠伤寒沙门氏菌(表4)。所有其他样本的两种病原体均呈阴性。双重qPCR-HRM检测试剂盒中观察到的所有结果均与经过验证的TEK 2细菌鉴定系统的结果匹配,从而确保了开发的检测试剂盒准确检测现实世界样本的适用性。
表1 使用25个商业样本(C-1至C-30)和4个监管样本(R-1至R-4)进行现实世界样本评估。使用TEK 2细菌鉴定系统。
综上所述,本工作报告了一种标准化且经过充分验证的双重qPCR-HRM检测法,用于检测肉类产品中单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌。该检测试剂盒根据ISO 22118:2011标准进行了专门验证,以最大限度地提高其准确性和可靠性,作为肉类和肉类制品的国际微生物学测试方法。这项研究存在某些缺陷,例如食物矩阵范围狭窄、现实样本测试有限以及引发剂浓度失衡可能影响灵敏度。该检测方法仍然需要在广泛的食品矩阵上进行测试,特别是在非肉类食品上,以确保其适用性。此外,还可以考虑通过更快/自动化的DNA提取以及使用96或384孔PCR设置的高通量检测来增加通量。因此,解决这些额外的要求提供了一个潜力,这种测定不仅用于食品检测,而且在临床诊断和流行病学监测。
HRM技术具有作为一种易于执行的检测方法的高度优势,用于在单一反应中识别两种病原体。在此基础上,该检测法的改进版本或新检测法还可以带有额外的PCR,可以在即使是微小的温度变化中识别单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的不同血清型。这可以通过血清型/物种之间的序列比较、识别差异序列并创建具有不同解链谱的PCR来实现,从而使多重化成为可能。因此,所开发的检测方法在检测食品病原体方面具有实用性,符合国际要求,并且还可以作为未来开发稳健、准确和可靠的检测方法的改进指南。
原文链接:https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.143245
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