研究背景：传统检测方法遇瓶颈，细菌漆酶成新希望

邻苯二酚作为石化、化工和制药行业的常用原料，广泛存在于工业废水中，浓度可从几毫克 / 升到 8000 毫克 / 升不等。其不仅对水生生物构成威胁，还可能通过皮肤接触引发湿疹性皮炎，经口摄入甚至具有致癌性，被国际癌症研究机构列为 “可能对人类致癌” 的 2B 类物质。

目前，邻苯二酚的检测方法主要包括高效液相色谱、气相色谱等色谱法和分光光度法，但这些方法依赖昂贵设备和专业操作人员，且样品预处理繁琐，难以实现实时检测。电化学传感器虽成本较低，但易受相似氧化还原电位化合物的干扰。

漆酶作为一种多铜氧化酶，能催化氧化多种酚类化合物，在生物传感器领域具有广阔应用前景。然而，传统研究主要集中在真菌漆酶，其在极端 pH 和温度条件下易失活，且培养条件复杂，限制了工业应用。相比之下，细菌漆酶，尤其是 CotA 漆酶，具有更宽的 pH 适应范围和更高的热稳定性。例如，地衣芽孢杆菌 CotA 漆酶在 70℃孵育 1 小时后仍保留 43% 的活性，而真菌漆酶仅保留 5%。

技术突破：CotA 漆酶传感器的构建与性能

传感器制备：创新材料组合实现高效 immobilization

研究团队将地衣芽孢杆菌的 cotA 基因克隆到 pET28a (+) 载体中，在大肠杆菌 Rosetta (DE3) pLysS 中过量表达。纯化的 CotA 漆酶与导电聚合物聚 3,4 - 乙撑二氧噻吩 - 聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）和壳聚糖（CS）混合，滴涂在丝网印刷电极（SPE）上，构建成电化学传感器。

PEDOT:PSS 具有良好的导电性，而壳聚糖作为天然高分子，可与 PEDOT:PSS 形成稳定的三元网络结构，为酶提供亲水微环境，同时起到生物保护作用。实验表明，当壳聚糖浓度为 1.2mg/mL 时，传感器薄膜在水中稳定性最佳，无明显崩解。

性能表征：低检测限、高灵敏度与优异稳定性

该传感器对邻苯二酚的检测表现出色，线性范围为 1-400μM，检测限低至 1.4μM，灵敏度达 42.637μA/mM。与其他基于真菌漆酶的传感器相比，其检测限和灵敏度相当，甚至更优。例如，基于 Trametes versicolor 漆酶的传感器检测限最低为 1.5μM，而该研究中的 CotA 漆酶传感器在检测限和稳定性上均具优势。

在稳定性方面，传感器在 4℃储存 40 天后仍保留 90% 的初始活性，远优于多数真菌漆酶传感器。例如，有研究报道真菌漆酶传感器在 4℃储存 22 天后仅保留 58%-69% 的活性。此外，该传感器在中性 pH 条件下仍能保持较高催化响应，仅比最佳 pH（5.0）下的响应降低约 10%，这一特性使其更适合实际环境监测。

选择性与实际样品检测：抗干扰能力强，适用于真实环境

传感器对邻苯二酚具有高选择性，当检测 50μM 邻苯二酚时，其他酚类化合物如多巴胺、愈创木酚、对苯二酚等的干扰极小，相对响应均低于 10%。这种选择性源于 CotA 漆酶与邻苯二酚的高亲和力，以及电化学检测电位的优化设置。

研究团队还将传感器应用于自来水和 Yamuna 河流水样检测。样品经简单稀释后，无需复杂预处理，即可准确检测出添加的 20μM 和 300μM 邻苯二酚，回收率在 95.5%-107.5% 之间，相对标准偏差低于 7.5%，表明其在实际环境样品检测中具有良好的可靠性。

图 1.CotA 漆酶的过表达和纯化。纯化的野生型 CotA 漆酶 （His6X-CotA） 与蛋白质分子量标准（Marker）。以 ABTS 为底物的野生型 CotA 漆酶的酶谱分析。

图 2.CotA 漆酶对儿茶酚氧化的研究。（A） 酚类和 4-氨基安替比林之间漆酶介导的氧化偶联方案。（B） 紫外-可见光谱显示漆酶介导的邻苯二酚和 4-氨基安替比林的偶联。实线表示 0 小时时的起始混合物，而虚线和虚线表示反应随时间的变化。测定混合物在 100 mM 乙酸盐缓冲液 （pH 4.0） 中含有 0.1 mg/mL 儿茶酚、0.2 mg/mL 4-氨基安替比林和 1.4 U/mL CotA 漆酶。

图 3.（A） 使用铁氰化物（Fe（CN） 改性电极在 50 mM Fe（CN） 6 3-/4- 6 3 /Fe（CN） 6 4 中）对裸电极和改性电极进行电化学表征。裸露的 0.1 M PBS 缓冲液 （pH 7.4） 和 0.1 M KCl 获得的循环伏安图。（B） 表示裸 SPE 和改性 SPE 的电化学阻抗谱的奈奎斯特图。以 50 mM 的 Fe（CN） 6 3-/4- 氧化还原对记录测量值。频率范围从 0.1 M PBS 缓冲液 （pH 7.4） 中的 10 5 和 Hz 正式电位下的 0.1 M KCl 到 0.1 Hz。插入电路是用于拟合实验结果的等效电路模型（R 电阻，R f：薄膜电阻，R ct：电荷转移电阻;C f s ： 溶液 ： 薄膜的电容， CPE ： 恒相元件， W ： Warburg 阻抗）。插图是改性电极的奈奎斯特图的放大视图。（C） 使用邻苯二酚对裸电极和改性电极进行电化学表征。在乙酸盐缓冲液 （pH 5） 中的儿茶酚 （1 mM） 中使用裸电极和修饰电极获得的循环体积图。（D） 生物传感平台的配置和通过 SPE/PEDOT：PSS/CS/CotA 检测儿茶酚的机制。缩写： RE： 参比电极， WE： 工作电极， CE： 对电极， SPE： 丝网印刷电极

行业影响：开启细菌漆酶应用新范式

对比传统真菌漆酶：成本与稳定性双优势

与真菌漆酶相比，细菌 CotA 漆酶的生产具有明显优势。细菌生长速度快，培养条件简单，可大幅降低生产成本。此外，CotA 漆酶的高稳定性使其在储存和使用过程中更具优势，尤其适合野外环境监测和工业现场检测。

环境监测与生物修复：从实验室走向实际应用

该研究不仅为邻苯二酚的检测提供了新方法，也为其他酚类污染物的监测开辟了道路。未来，通过优化传感器设计和集成便携式分析设备，有望实现现场快速检测，为环境污染预警和治理提供实时数据支持。

此外，CotA 漆酶在生物修复领域的应用也值得期待。其高效的催化性能和稳定性使其可能用于工业废水处理，降解多种酚类污染物，推动绿色生物技术的发展。

未来展望：微型化与集成化是发展方向

研究团队表示，下一步将聚焦传感器硬件的微型化，将其与便携式分析设备集成，开发适合现场应用的检测系统。同时，他们还将探索 CotA 漆酶在其他污染物检测中的应用，拓展该技术的适用范围。

随着环境监测需求的不断增加，这种基于细菌漆酶的高灵敏度、高稳定性生物传感器有望在环境科学、食品安全等领域发挥重要作用，为全球污染物监测提供创新解决方案。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2025.03.017