基于 MIRA–qPCR 的贝类诺如病毒 GII 高效检测技术研究

在食品安全领域，贝类产品的病毒污染问题一直是公众关注的焦点。诺如病毒GII作为引发急性胃肠炎的主要病原体之一，常与贝类相关联，给消费者健康带来潜在威胁。近期，一项创新的检测技术——MIRA–qPCR方法，为快速、准确地检测贝类中的诺如病毒GII提供了新的解决方案，有望在食品安全监测中发挥重要作用。

诺如病毒GII：贝类污染的关键病原体

诺如病毒是一种单链、正链、无包膜RNA病毒，因其高度传染性和引发大规模胃肠炎爆发的能力而备受关注。全球范围内，诺如病毒感染导致的经济负担巨大，仅在美国，每年因诺如病毒感染造成的直接医疗费用和生产力损失就高达106亿美元。诺如病毒GII是人类诺如病毒中最主要的基因群，其中GII.4是流行最为广泛的基因型。贝类，尤其是牡蛎等双壳贝类，因其滤食性特点，能够从受污染的水体中富集病毒颗粒，成为诺如病毒传播的重要载体。一旦消费者食用了受污染的贝类，就可能引发大规模的食源性疾病爆发。

MIRA–qPCR：创新的检测技术

为了应对贝类中诺如病毒GII的检测挑战，研究人员开发了一种结合多酶等温快速扩增（MIRA）和定量聚合酶链式反应（qPCR）的新型检测方法，即MIRA–qPCR方法。该方法通过针对诺如病毒GII基因组中高度保守的区域设计引物和探针，实现了对病毒核酸的精准检测。与传统的RT-PCR方法相比，MIRA–qPCR技术具有显著优势：它仅需20分钟的等温扩增即可完成检测，无需复杂的温度循环设备，大大缩短了检测时间。此外，该方法还避免了传统PCR方法中可能出现的非特异性扩增问题，提高了检测的准确性和可靠性。

图1 利用MIRA-qPCR技术快速检测诺如病毒GII的流程示意图。检测过程分为三个步骤：(A) RNA提取与逆转录；(B)通过MIRA-qPCR进行基因扩增与荧光信号采集，即a.形成Rec/SSDNA复合物；b.入侵模板并形成D环区域；c.DNA链延伸；d.探针杂交；e.释放荧光基团；(C)获得扩增曲线并读取结果。

技术优势：快速、灵敏、特异

MIRA–qPCR方法在检测诺如病毒GII时展现出了卓越的性能。在特异性测试中，该方法仅对诺如病毒GII产生阳性反应，而对其他常见的肠道病毒和食源性病原体，如札如病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌和副溶血性弧菌等均无交叉反应。这表明MIRA–qPCR具有高度的特异性，能够准确识别目标病毒。

图2 特异性分析。（A）a：10⁵拷贝/μL（诺如病毒GII）；b：10⁵拷贝/μL（札如病毒）；c：10⁵拷贝/μL（甲型肝炎病毒）；d：10⁵拷贝/μL（轮状病毒）；e：10⁵菌落形成单位/毫升（大肠杆菌）；f：10⁵菌落形成单位/毫升（单核细胞增生李斯特菌）；g：10⁵菌落形成单位/毫升（副溶血性弧菌）；h：阴性对照。（B）Ct值图是根据（A）中所示的扩增图计算得出的。

在灵敏度方面，MIRA–qPCR能够检测到低至1.62拷贝/微升的重组质粒标准，其检测灵敏度是常规PCR的100倍。此外，该方法在1.62×10¹至1.62×10⁷拷贝/微升的范围内表现出良好的线性关系，R²值大于0.90，说明其定量检测结果准确可靠。

图3 利用MIRA-qPCR和常规PCR检测诺如病毒GII的最低检测限（LOD）相关结果。（A）扩增曲线显示MIRA-qPCR的LOD。NC：阴性对照。（B）Ct值图是根据（A）中所示的扩增图计算得出的。（C）使用Origin 2021软件获得Ct值与诺如病毒GII对数浓度之间的线性回归标准曲线以及95%置信区间。（D）常规PCR的LOD。M：D2000 Marker，泳道0-7；对应的诺如病毒GII浓度为1.62×10⁰~10⁷拷贝 /μL；泳道8：阴性对照。

实际应用：贝类检测中的表现

为了验证MIRA–qPCR方法在实际贝类样本检测中的有效性，研究人员对125份新鲜贝类样本进行了检测，并与qPCR方法进行了对比。结果显示，两种方法的检测结果具有良好的一致性，Kappa值为0.90（p<0.001），表明MIRA–qPCR方法在检测贝类中诺如病毒GII时具有100.00%的灵敏度和97.25%的特异性。这一结果证明了MIRA–qPCR方法不仅在实验室条件下表现出色，在实际应用中也具有很高的准确性和可靠性，能够为贝类产品的安全检测提供有力支持。

表1 MIRA-qPCR与qPCR筛查125份贝类中诺如病毒GII的分析

未来展望：食品安全监测的新希望

MIRA–qPCR方法的出现为食品安全监测领域带来了新的希望。其快速、灵敏、特异的检测能力使其在贝类中诺如病毒GII的检测方面具有明显优势。然而，这一技术的应用范围不应仅限于贝类。未来，研究人员可以进一步探索其在其他易受病毒污染的食品中的应用潜力，如新鲜果蔬等，以更全面地保障食品安全。此外，随着技术的不断优化和改进，MIRA–qPCR方法有望在更多的检测场景中得到应用，为食品安全监测提供更高效、更准确的技术支持。

总之，MIRA–qPCR方法作为一种新型的病毒检测技术，在贝类中诺如病毒GII的检测中展现出了巨大的潜力。它不仅能够快速、准确地检测出病毒的存在，还具有操作简便、成本较低等优点。随着这一技术的进一步推广和应用，我们有理由相信，它将在食品安全监测领域发挥越来越重要的作用，为保护公众健康做出重要贡献。

参考文献：

Zhu Y, Song M, Pan Y, et al. Evaluation and Application of the MIRA–qPCR Method for Rapid Detection of Norovirus Genogroup II in Shellfish[J]. Microorganisms, 2025, 13(4): 712.