抗生素耐药性对现代医学构成严峻挑战，而传统药敏检测（AST）难以识别极低频（10⁻⁶–10⁻⁷）的耐药亚群。异质性耐药（HR）指敏感菌群中潜伏的稀有耐药亚群，抗生素压力下可导致治疗失败。当前临床方法（如纸片扩散法、微量肉汤稀释法）及金标准PAP检测或灵敏度不足，或耗时费力，亟需新策略。本研究开发了一种基于微流控液滴的高通量HR检测技术：通过将数百至数千个细菌与抗生素共包裹于微滴中，利用耐药菌生长引发的渗透性液滴收缩效应（通过显微镜动态监测），仅需200–300个微滴即可检出10⁻⁶的耐药亚群，较现有微流控方法（需500万滴）效率提升4个数量级。该技术在多株临床血流感染大肠杆菌（WHO优先病原体）中验证了三类常用抗生素的HR检测能力，与PAP结果一致，且通过集成多联芯片进一步实现高通量分析。

技术原理与创新​：

1.群体封装与渗透压检测​​：将100–3000个细菌与抗生素共包裹于液滴中，耐药亚群生长会代谢产酸，引发液滴渗透性收缩（5–10%体积变化），通过显微镜动态监测即可识别（如Figure 1）。通过物理-生物耦合效应，将耐药性转化为可量化的液滴体积变化。

Figure 1  显示该技术概述的示意图（A）；针对多种抗生素，使用多个液滴发生器和孵育室 （B）；每个液滴都含有抗生素和大约 400 到 3000 个有荚膜的细菌（C）。

​​2.超高灵敏度与效率​​：该技术仅需分析200–300个液滴即可检出10⁻⁶的耐药亚群，较传统单细胞封装微流控技术（需500万液滴）效率提升2万倍。通过调整细菌封装密度（如Figure 2），优化了空液滴与生长液滴的比例，确保低丰度耐药亚群的可靠检测。

Figure 2  MH 肉汤中每毫升 CFU 不同的 MG1655 具有不同数量的细菌包膜和生长液滴。（A）（i）10⁴ cFU/ml，（ii）
0 小时的图像，以及（iii）24小时的图像以及尺寸。（B）（i）10⁵ cFU/ml，（ii）0小时图像，以及（iii）24小时图像（C）（i）5 × 10⁵ cFU/ml，（ii）图像0小时，以及（iii）24小时时的图像。具有黄色边界的水滴表示没有生长的水滴，而具有红色边界的水滴表示显示细菌生长的液滴。

​​验证与应用：

​​1.临床菌株验证：

在血流感染分离的大肠杆菌（WHO重点病原体）中，成功检测出对β-内酰胺类（头孢噻肟）、氨基糖苷类（庆大霉素）和四环素类抗生素的HR表型，与PAP结果高度一致（如Figure 3）。临床相关性验证为技术转化奠定坚实基础。

Figure 3  在抗生素存在的情况下，用耐药大肠杆菌加标易感的大肠杆菌，以检测耐药大肠杆菌的亚群。对于不同的情况，将标准化的液滴大小与时间作图。（A） 在 CTX 存在下 （2 mg/L） 的 MG1655 CTX 和抗性菌株DA62594频率为 10⁻³。CFU/ml = 2.5 × 10⁷。（B） 在 CTX 存在下 （10^-5 mg/L） 频率为 10^-5 的 MG255 CTX 抗性菌株DA62594。CFU/ml = 5 × 10⁸。（C） 在 CTX 存在下 （2 mg/L） 以 10^-6 的频率DA62594 MG1655 CTX 抗性菌株。CFU/ml = 5 × 10⁸。（D） 在 GEN 存在下以 10^-5 频率 （4 mg/L） 的 MG1655 GEN 抗性菌株DA63654。CFU/ml = 5 × 10⁸。（E） 在 GEN （4 mg/L） 存在下具有 10^-6 频率的 MG1655 GEN 抗性菌株DA63654。CFU/ml = 5 × 10⁸。（F） MG1655 TET 抗性菌株DA34827在 TET （5 mg/L） 存在下具有 10^-5 的频率。CFU/ml = 5 × 10⁸。（G） 在 TET 存在下具有 10^-6 频率的 MG1655 TET 抗性菌株DA62594

2.多联芯片开发：

该技术设计多通道微流控芯片，可同步检测同一菌株对多种抗生素的HR表型（如Figure 4），12–24小时内输出结果，显著缩短检测时间。该多联芯片开发过程中攻克了多项技术难题：交叉污染控制层面通过优化微通道流体动力学参数，实现了不同药物条件的完全隔离，交叉污染率<0.1%。液滴均一性控制层面开发了新型表面处理工艺，使不同通道生成的液滴直径变异系数<2%。并行检测技术层面创新性地采用多光谱成像系统，可同时追踪多个通道的液滴动态变化。

Figure 4  两种不同抗生素对 10⁵ CFU/ml 敏感 MG1655 的影响。（A） CTX（2 毫克/升）。（B） GEN （0.5 毫克/升）。MG1655 在三种抗生素的三个独立实验。

尽管本研究开发的微流控液滴技术为细菌异质性耐药检测提供了突破性解决方案，但仍存在若干值得深入探索的方向和亟待解决的局限性。从技术优化角度来看，当前系统在区域特异性折点（如ECOFF值）的适用性验证方面仍需完善，这需要开展多中心临床研究以建立标准化的判读标准；同时，检测通量虽已显著提升，但通过开发6-8通道的升级版芯片，并集成AI辅助判读系统，有望实现更全面的抗生素组合覆盖和更智能化的结果分析。在临床应用转化层面，自动化程度仍有提升空间，特别是液滴分选系统的集成将大大简化操作流程，使技术更适用于常规临床实验室环境；此外，建立标准化的质控体系和多中心验证网络，对推动该技术成为行业金标准至关重要。从科学研究视角，该平台的扩展应用潜力巨大，不仅可拓展至其他重要病原体（如金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等）的耐药性监测，还能用于研究细菌耐药性进化的动态过程，为理解异质性耐药的形成机制提供新工具。当前技术的主要局限性体现在三个方面：首先，对于某些特殊耐药机制（如生物膜相关耐药）的检测灵敏度仍需优化；其次，极端低频突变（<10^⁻⁷）的检测仍具挑战性；最后，临床样本前处理方法尚需标准化以确保检测重现性。这些局限性的突破将依赖于微流控技术、分子生物学和人工智能等领域的交叉创新。未来5-10年，随着精准医学和个体化治疗理念的深入，该项技术有望发展成为临床微生物实验室的常规检测平台，并为抗生素的合理使用提供重要决策支持，最终实现从"经验性用药"向"精准抗感染"的范式转变。

原文doi：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adv4558