研究背景

MicroRNA（miRNA）是调控基因表达的关键非编码RNA，其异常表达与肝癌、乳腺癌等多种癌症密切相关。其中miRNA-221 在肝癌组织中过表达，可作为肝癌的早期诊断标志物。双链互锁DNA纳米结构（DSDN）作为一种经典的DNA纳米结构，因其优异的稳定性和抗纠缠特性，已被广泛用于细胞内递送和生物传感。与单链自锁DNA纳米结构（SSDN）相比，后者大多需要复杂的结构转变，导致可能的结构不稳定和转换效率低，直接由互补的 Watson-Crick 碱基配对构建的 DSDN 可以相对移动，具有较大的旋转和平移自由度，从而提供更大的灵活性、稳定性和平移性。DSDN的这些力学性能使得构建具有高稳定性、抗纠缠和结构域富集等优点的前所未有的DNA行走器成为可能。受此启发，本研究将DSDN引入二维DNA步行器中，并基于它构建了电化学生物传感器，成功解决了传统 DNA 行走者的复杂转化和稳定性差的问题。

研究原理

图1 双环DNA步行器的构建和基于DCDW的miRNA-221检测生物传感器的构建

在这项研究中，设计了一种具有双链互锁结构和多功能结构域的双圈DNA行走器（DCDW），以开发一种用于快速高效检测miRNA-221的超灵敏电化学生物传感器。如图 1 所示，三条 DNA 链（Y1、Y2、Y3）自组装形成 DNA Y 形支架，可以携带更多的信标材料（图 1A）。然后，C1和C2可以在保护链（P）和T4 DNA连接酶的帮助下杂交以产生完整的DCDW（图1B）。随后，如方案1C所示，当目标miRNA-221（T）存在时，T可以通过与其上的互补链P杂交来激活DCDW，形成P-T双链体，随后，DNA燃料（F）可以与P-T双链体杂交以产生P-F双链体，从而释放T以参与下一个循环。因此，少量的靶标可以激活大量的DCDW。当激活的DCDW在改性电极（支架/depAu/GCE）表面行走时，在Mg²⁺的辅助下可以识别并切割Y形支架上的特定序列，导致大量的二茂铁 （Fc） 离开电极表面，电流响应显着降低。因此，利用高效的 DCDW 能够以卓越的灵敏度检测靶标 miRNA-221，实现低至 1.9 aM 的检测限。最重要的是，这种灵敏检测miRNA-221的策略可以为构建新型二维DNA行走者提供新的见解，并可以扩展到检测其他代表性疾病生物标志物，为生物分析提供新的途径。

研究结果

1. 超快反应速度 

- 15分钟完成检测（传统方法需60-90分钟） 

- 反应速率提升300%：起始速率达-20.94 μA/h（图2B）

图2 各类检测器的反应速度及检测时间

2. 超高灵敏度 

- 检测限1.9 aM：相当于每毫升样本含有低至1140个miRNA分子都可被检测到

- 线性范围跨越5个数量级：10 aM – 1 nM（图3A-B） 

图3. 检测性能验证

3. 卓越特异性与稳定性 

- 干扰物质无响应：10 nM miRNA-21/155/141均无显著信号变化（图3D） 

- RSD <5%：批内/批间重复性优异（图3C） 

- 20次循环扫描信号漂移<2%（图3E） 

4. 临床样本验证 

- 肝癌细胞（MHCC97L）：10³个细胞即可检出信号 

- 对照细胞（HeLa）：即使达到10⁴个细胞仍无响应（图4） 

图4. 癌细胞检测结果

5. 效果比对

总结与展望

基于DCDW的生物传感器在检测肝癌标志物方面起到了很好的效果，后续可以朝着POCT设备集成发展，结合微流控芯片实现床边检测；也可设计不同保护链检测miRNA组合谱，结合不同的靶标，实现多靶标同时检测；还可以扩展技术，动态追踪术后miRNA表达变化，以实现癌症患者术后康复效果的追踪。

双环DNA步行机通过结构创新（双链互锁）与机制优化，解决了分子纳米机器稳定性与效率的固有矛盾。其15分钟、aM级的检测性能不仅适用于癌症诊断，更为感染性疾病病原体筛查、遗传病突变检测等领域提供通用技术平台。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116719