铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种革兰氏阴性机会性细菌，常引发免疫受损患者（如慢性阻塞性肺病、癌症、创伤、烧伤及败血症患者）的急慢性感染，占院内感染的11%，显著提升死亡率和发病率。早期识别对及时治疗至关重要，但传统方法如细菌培养耗时长、步骤复杂，PCR方法则需专业设备与操作人员，难以满足临床快速检测需求。近年来，核酸适配体因特异性高、稳定性好、成本低等优势，被广泛用于构建生物传感器用于病原菌检测；链置换扩增（SDA）作为快速等温的核酸扩增技术，操作简便，但传统SDA存在灵敏度低、探针繁多、背景信号高等问题。

为此，本研究建立了一种“适配体识别-信号转化-链置换扩增”的一体化检测策略。该平台设计了发夹探针（HP）和双重自杂交探针（DP）两种核酸探针：HP为发夹状单链DNA分子，其结构中包含F23适配体序列和互补序列，通过自身的发夹结构设计实现对PA的特异性识别和信号转化——首先利用F23适配体特异性结合PA表面的特定蛋白，结合后HP构象发生变化，暴露出“1”区段的核酸序列；DP由FAM标记的s1序列和BHQ标记的s2序列组成，整合SDA所需的关键功能区段，并通过双自引物设计实现信号循环放大。HP暴露出的“1”区段与DP的“1*”区段结合，DNA聚合酶/内切酶辅助的SDA反应。在该反应中，通过DNA聚合酶介导的链延伸、内切酶的切割及链置换，持续产生荧光信号。整个过程可在室温下完成，仅需孵育60分钟，操作简便（图1-3）。

该方法的荧光强度比值（F/F₀）与PA浓度对数呈良好线性关系（回归方程F/F₀=4.956×lgC-0.07240，相关系数0.993），检测限低至1.6 cfu/mL，对PA的特异性显著高于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌（图4）。其稳定性和重复性良好，高（10⁴cfu/mL）、低（10²cfu/mL）浓度PA检测的相对标准偏差均低于10%。在血清样本中进行加标实验，回收率达98.12%-101.26%，表明该方法适用于复杂样本的准确检测。相比无DNA聚合酶/内切酶辅助的对照方法，该策略信号响应增强2.53倍，灵敏度显著提高；与传统菌落计数法具有高度一致性（相关系数0.9976）（图5）。

综上所述，本研究开发了一种基于适配体的荧光检测方法，可在无需细菌培养的前提下，实现对PA的快速、高灵敏度检测。该方法结合双自引物探针与酶辅助SDA扩增技术，有效实现信号高效放大。此外，该平台具有良好的扩展性，只需更换适配体序列即可适用于其他病原体的检测，具备在感染性疾病的早期筛查、床旁检测及个体化治疗中的广泛应用潜力。本研究为传染病快速诊断与精准治疗提供了坚实的技术基础。

图1  基于核酸适配体的PA检测方法的工作原理。该方法通过核酸适配体特异性识别PA表面蛋白，暴露出特定的核酸序列，启动SDA反应，最终通过荧光信号实现高灵敏度检测。这一过程包括特异性识别、信号转化、链置换扩增和信号放大四个关键步骤。

图2  荧光标记发夹探针（HP）的构建及其识别目标细菌的可行性。（A）HP组装前后的荧光光谱。HP两端分别标记荧光基团（FAM）和淬灭基团（BHQ-1），因发夹结构的存在，初始荧光被淬灭。（B）HP与目标细菌及干扰细菌孵育时的FAM信号。与目标菌PA作用后，HP荧光信号显著增强（约为初始强度的3.23倍）；而与干扰菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌）作用时，荧光强度较低，与阴性对照（处于发夹结构的HP）相当，表明HP对PA具有高特异性。

图3  基于双自杂交探针（DP）的SDA系统可行性验证。（A）FAM标记的s1序列与s2序列组装成DP，维持低背景信号。（B）DP参与的SDA系统的可行性：当DP、HP、PA、DNA聚合酶和内切酶共同存在时，荧光信号显著增强，表明DP能介导DNA聚合酶/内切酶辅助的链延伸与置换过程，实现信号放大。

图4  （A）不同浓度PA的荧光光谱。随着PA浓度升高（10~10⁶ cfu/mL），荧光信号强度逐渐增强。（B-C）荧光强度比值（F/F₀，其中F为PA存在时的荧光强度，F₀为空白对照的荧光强度）与PA浓度的对数值呈良好线性关系，回归方程为F//F₀=4.956×lgC−0.07240，相关系数为0.993，且根据3δ规则确定检测限低至1.6 cfu/mL。（D）该方法对PA及其他致病菌的检测特异性（NC为阴性对照）。

图5  （A）比较了本研究的“DNA聚合酶/核酸内切酶辅助链置换扩增方法”与“无该辅助的对照方法”检测不同浓度PA时的F/F₀），结果显示本方法信号响应更高（为对照方法的2.53倍），证明其灵敏度优于仅依赖链置换扩增的方法。（B）对比本方法与传统菌落计数法计算的PA浓度，结果显示两者高度一致（相关系数0.9976），表明本方法可作为临床PA检测的有效替代策略。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.microc.2025.113687