研究背景

副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）是该属中一种突出的海洋病原体，广泛分布于贝类、鱼类和甲壳类动物中，仍然是全球海鲜相关食源性疫情的主要原因之一。副溶血性弧菌感染可导致急性胃肠炎，以腹泻、呕吐和腹痛为特征，严重时可能发展为败血症，对人类健康构成严重威胁。随着全球海鲜消费量的增加，对 V.副溶血性弧菌及其相关物种的快速、灵敏和特异性检测的需求对于预防食源性疫情和保护公众健康变得越来越紧迫。

传统的检测方法主要依赖于细菌培养和聚合酶链反应（PCR）。然而，基于培养的测定需要连续稀释、选择性富集、多轮分离和生化鉴定，通常需要 5-7 个工作日才能获得明确的结果。尽管基于 PCR 的测定具有很高的灵敏度，但引物设计受到弧菌物种之间遗传相似性的挑战，通常需要测序确认，从而增加了成本和周转时间。临床微生物学和食品安全应用迫切需要一个超灵敏（≤10 CFU/μL）、物种特异性、用户友好且具有视觉可解释性的实时检测平台。

噬菌体（噬菌体）是通过专门的结构蛋白识别细菌表面并结合细菌来特异性感染细菌的病毒。噬菌体-细菌相互作用具有高度特异性，每个噬菌体通常只感染单个物种或狭窄范围的细菌菌株。除了其内在的靶向能力外，噬菌体还为遗传和结构工程提供了一个多功能平台，能够开发各种基于噬菌体的病原菌检测策略，例如噬菌体介导的细菌裂解触发的生物发光检测、基于噬菌体扩增的比色测定，并通过基因工程荧光素酶表达噬菌体增强光学检测。

为了解决野生型噬菌体应用的固有局限性，将工程化噬菌体的可编程显示功能与野生型噬菌体的天然宿主靶向结构相结合，提供了一种有效且通用的解决方案（Huss 和 Raman，2020）。在各种候选药物中，T4噬菌体（T4）因其强大的结构稳定性、注释良好的基因组和卓越的表面修饰性而脱颖而出，成为理想的生物工程平台。其衣壳密集地装饰有两种主要的辅助蛋白——小外衣壳蛋白（Soc，∼870拷贝）和高免疫原性外衣壳蛋白（Hoc，∼155拷贝）（Zhu et al.， 2023）——可作为功能部分的高容量展示位点。通常，T4 上的表面显示是通过使用转基因支架 T4ΔHS 噬菌体 （T4ΔHS） 来实现的，其中 Hoc 和 Soc 蛋白都被删除。外源蛋白质与Hoc或Soc融合，随后在体外重组装到T4ΔHS衣壳上以进行多价展示（Liu等人，2020年;任等人，1996 年;Zhang 等人，2019 年）。

本研究团队之前开发了一种暗场显微镜 （DFM） 检测方法，利用金纳米颗粒 （GNPs） 等离子体探针来检测病原体。由于其局部表面等离子体共振 （LSPR） 特性，GNP 在暗场照明下产生强烈的光散射，在高对比度的黑色背景下产生明亮的光学特征。在该系统中，我们构建了基于T4的双显示平台，在地表同时呈现野生型TSP和GNP。这种设计使探针在目标细菌上密集富集，在DFM下产生明亮的金色棒状散射图案，以实现实时可视化和定量检测。并开发了一种人工智能 （AI） 辅助分析系统。该平台能够对噬菌体标记的细菌颗粒进行精确和自动计数，显着减少人工错误和劳动力需求，同时提高高通量病原体可视化和鉴定的效率、可扩展性和可靠性。

研究原理

图1 工程化T4@TSPs@GNPs探针的构建与应用示意图

1. 双功能噬菌体探针设计

-底盘载体：选用 T4ΔHS噬菌体（删除天然Hoc/Soc蛋白，提供高容量展示位点） 

- 靶向模块：将副溶血性弧菌噬菌体VPp1的尾部刺突蛋白（TSP）融合至T4小外壳蛋白（Soc），形成Soc-VP-TSP

- 信号模块：将生物素受体肽（Avi-tag）融合至T4高免疫原性外壳蛋白（Hoc），形成Avi-Hoc

- 自组装：双融合蛋白共展示于T4ΔHS，形成 T4@TSPs@Avi中间体

2. 金纳米粒子信号放大

- 生物素化：BirA连接酶催化Avi-tag位点特异性生物素化 

- GNPs偶联：与 5 nm链霉亲和素包被金纳米粒子（SA-GNPs） 结合（约30 GNPs/病毒粒子），形成最终探针 T4@TSPs@GNPs 

图2 T4@TSPs@GNPs探针的表征

TEM验证显示：10 nm GNPs易聚集，15 nm GNPs可能阻碍TSP结合位点，而5 nm GNPs空间兼容性最佳（图2D）。金纳米粒子在光照下产生 局域表面等离子体共振（LSPR），散射强烈白光。当探针密集结合于细菌表面时，目标菌在暗场下呈现 高对比度的金色杆状结构。

4. AI驱动的智能识别系统 

针对复杂样本中杂质干扰，开发 DenseNet169深度学习模型： 

- 动态ROI提取：基于显著性图谱裁剪目标区域（图3C） 

- 多尺度特征融合：兼顾细菌形态与微尺度纹理（图3B） 

- 可解释性分析：Grad-CAM可视化决策区域（图3D） 

图3：AI模型架构与决策可视化

研究结果：性能碾压传统方法

1. 超高灵敏度与特异性 

- 检测限：低至 4 CFU/μL（图4A），较现有快检技术提升10–100倍 

- 特异性：在溶藻弧菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌共存下，仅靶向副溶血性弧菌

- 线性范围：9.2×10⁻³ ~ 7.36×10⁻¹ CFU/μL（R²=0.998） 

 2. AI模型精准识别 

- 准确率100%：测试集完美区分目标菌与非目标杂质（图5A） 

- 抗干扰能力：在含颗粒物/光晕的复杂样本中，召回率与精确率均达100%

3. 真实样本验证 

- 人工污染样本（副溶血性弧菌+大肠杆菌+沙门氏菌）：检出率100% 

- 临床样本（污水/病虾组织）：与平板计数结果完全一致（图5C） 

图4：不同浓度副溶血性弧菌的暗场成像

图5：临床样本检测与AI性能验证

效果与展望

与传统培养法和PCR技术相比，本技术在检测时间、灵敏度和设备需求上均有显著的优势：

总的来说，本研究通过集成双站点工程T4、GNP和AI辅助图像识别，提出了一个模块化的智能病原体检测平台。通过在同一噬菌体衣壳上同时显示副溶血性弧菌特异性 TSP 和 Avi，该系统能够以超低的检测限在 DFM 下实时和高度特异性地可视化目标细菌。人工智能分类模型的结合使检测过程高度自动化，显着提高了吞吐量，同时最大限度地减少了人为错误。该系统在食品安全、环境监测和快速临床诊断方面具有强大的应用潜力。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117830