食品安全问题已成为全球关注的热点，其中食品源性病原体是导致食源性疾病的主要原因。根据世界卫生组织2024年的数据，超过250种食源性病原体（包括沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和李斯特菌）每年导致全球6亿例疾病和1100亿美元的经济损失。这些病原体不仅威胁人类健康，也给食品行业带来巨大挑战。传统的细菌检测方法如培养平板法、ELISA和PCR虽然各有优势，但都存在明显不足：培养平板法需要48-72小时才能获得结果，ELISA灵敏度不足，PCR操作复杂且需要繁琐的预处理步骤。因此，开发一种操作简单、快速且高灵敏度的多重细菌检测方法具有重要的现实意义。本研究通过整合微流控技术和分子生物学技术，实现了对三种常见食源性病原体的高效检测。

核心技术特点​：

1. 智能微流控芯片设计​​：如Figure 1所示该微流控芯片采用双层PDMS结构，通过等离子体键合工艺制造，整体尺寸为87×57×7 mm。芯片设计充分考虑了功能集成和操作便利性，包含多个功能模块：三个按压腔室作为流体驱动源，采用直径12.4mm的圆柱形设计，顶部设有1mm直径的通气孔；三个预存储室分别用于存放细菌样品混合液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，采用菱形腔室设计以优化液体流动；三个气动止回阀确保液体单向流动，防止交叉污染；独特的蛇形DNA提取通道（33mm长）增加了磁珠捕获面积；创新的旋转阀设计（直径5.1mm）实现了液体流向的精确控制；五个圆柱形反应室（直径5mm）为RAA反应提供了理想环境。这种模块化设计使芯片能够完成从样品处理到结果检测的全流程。

Figure 1  该手指驱动微流控芯片用于多重细菌检测的方案。（A）微流控芯片的设计;（B）微流控芯片的结构;（C-D）细菌检测的程序和方法;（E）便携式设备的设计。

​​2. 高效DNA提取系统​​：本研究创新性地采用了高梯度磁场技术。如Figure 2所示通过FEMM软件模拟比较发现，设计的高梯度磁场（0.97T-0.2T）明显优于普通永磁体（0.49T-0.18T）。实验证明，高梯度磁场能使磁珠在通道内形成致密的"磁珠墙"，而普通磁体只能形成"磁珠线"。这种密集排列显著增加了DNA结合面积，提高了提取效率。洗脱时间优化实验显示，10分钟洗脱可获得84%的DNA回收率，延长洗脱时间并不能进一步提高回收率。此外，多次洗涤实验证实磁珠在高梯度磁场中保持稳定，洗涤三次后仍无磁珠损失，确保了检测的重复性。

Figure 2  DNA纯化验证。(A)利用FEMM软件进行高梯度磁场与永磁体的模拟；(B)磁珠在通道内的分布情况：(a)高梯度磁场；(b)永磁体；(C)不同洗涤次数后收集溶液的吸光度（N=3）；(D)不同洗脱时间下的DNA回收率（N=3）。

实验优化与性能评估：

1. 实验条件优化：细菌裂解效率直接影响检测灵敏度，本研究系统比较了四种裂解方法。如Figure 3所示热裂解（75℃ 10分钟）和超声裂解（40kHz 3分钟）操作简单但效率较低；化学裂解（裂解液与样品1:1混合）效率较高但处理量有限；最终选择的核酸释放剂以5:1的样品体积比，在25-35℃下5分钟内即可完成裂解，DNA得率达76-93ng/μL，且完全在芯片上完成，避免了传统方法所需的离芯操作。温度实验表明，该裂解方法在25-35℃范围内效率稳定，非常适合现场应用环境。RAA反应条件经过多参数系统优化。温度梯度实验（37-43℃）显示39℃时扩增效率最高，荧光信号最强。时间梯度实验表明，25分钟反应时间足以完成扩增，延长至30分钟信号增幅不足5%。引物体积优化发现2.0μL（10μM）即可达到最大扩增效率，继续增加引物量仅带来边际效益。探针体积实验确定0.9μL（10μM）为最佳用量，过少会导致信号不足，过多则增加成本而不显著提高灵敏度。这些优化使检测体系在保证高灵敏度的同时，实现了试剂用量的最小化，降低了检测成本。

Figure 3  裂解与扩增方法的优化。(A)不同裂解方法的比较（N=3）；(B)不同裂解温度（20°C、25°C、30°C和35°C）的比较（N=3）；(C)不同扩增温度（37°C、39°C、41°C和43°C）的比较（N=3）；(D)扩增时间（10 min、15 min、20 min、25 min和30 min）与引物体积（1.5 μL、2.0 μL、2.5 μL和3.0 μL）的比较（N=3）；(E)探针体积（0.3 μL、0.6 μL、0.9 μL、1.2 μL和1.5 μL）的比较（N=3）。

2. 检测性能：经过系统优化后，该芯片展现出优异的检测性能。如Figure 4所示对沙门氏菌的检测限达15 CFU/mL，在1×10¹-1×10⁶ CFU/mL范围内呈现良好的线性关系（I=29.12lg(C)+9.64，R²=0.98）。对单核细胞增生李斯特菌的检测限为38 CFU/mL，线性范围为4×10¹-4×10⁵ CFU/m（I=36.95lg(C)-14.21，R²=0.98）。大肠杆菌O157:H7的检测限为48 CFU/mL，线性范围为5×10¹-5×10⁵ CFU/mL（I=22.19*lg(C)-3.21，R²=0.97）。这种高灵敏度完全满足食品安全监测的需求，且线性范围覆盖了食品中可能存在的病原体浓度范围。

Figure 4  该芯片在多重细菌检测中的性能表现。(A/C/E)三种细菌在最佳条件下的荧光强度(鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7)(N=3)；(B/D/F)三种细菌的校准模型(鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7)(N=3)；(G)该芯片的特异性(N=3)；(H)芯片与qPCR检测多种细菌效果的对比(N=3)。

该研究的主要创新点包括：1）首创将气动止回阀与旋转阀结合，实现了复杂流体控制的简单操作；2）开发高梯度磁场显著提高了DNA提取效率；3）全集成设计将样品处理、核酸提取、扩增和检测集成于单一芯片。与传统方法相比，该技术将检测时间从24-72小时缩短至45分钟，灵敏度提高1-2个数量级，成本降低约80%。这些优势使其在食品安全监管、临床诊断和环境监测等领域具有广阔应用前景。未来通过扩展检测靶标和优化芯片设计，有望开发出更强大的多病原体检测平台。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117750