研究背景

烟草黑胫病作为威胁全球烟草产业的毁灭性土传病害，其病原体寄生疫霉（Phytophthora nicotianae）可导致烟草减产超 75%，严重影响烟叶品质。传统检测方法如症状观察、病原体分离等不仅耗时耗力，还易因宿主 - 病原体多样性导致误判。尽管实时定量 PCR（qPCR）已成为主流分子检测工具，但其依赖标准曲线定量的特性在复杂样本中常受 PCR 抑制剂干扰，尤其在低病原体载量场景下灵敏度不足。

 数字 PCR 技术突破检测瓶颈

中国计量科学研究院联合山西大学、中国农业科学院烟草研究所等单位，开发出基于液滴数字 PCR（ddPCR）的高灵敏度检测方法。该技术通过将反应体系分割成数万至数百万个微滴，每个微滴独立进行 PCR 扩增，最终通过泊松分布计算目标核酸拷贝数，实现 “免校准” 绝对定量。

实验数据显示，ddPCR 对寄生疫霉的检测限（LoD95%）为 3.9 拷贝 / 反应，量化限（LoQ）为 11.6 拷贝 / 反应，在 10¹ 至 10⁵拷贝 / 反应的动态范围内线性关系优异（R²=0.9999）。相比之下，qPCR 虽检测限与 ddPCR 相近（3.91 拷贝 / 反应），但在低浓度样本中变异系数（RSD）显著高于 ddPCR，且受土壤基质抑制效应影响更大。在 252 份田间样本检测中，ddPCR 检出 208 份阳性（82.54%），其中 15 份 qPCR 漏检的低载量土壤样本（4-15 拷贝 / 反应）经测序验证为阳性，充分证明 ddPCR 在早期无症状感染检测中的优势。

图 1.开发靶向 P. nicotianae 的 ITS 序列的 ddPCR 检测。面板显示了在定量范围 （d） 上退火温度 （a）、引物/探针浓度 （b）、线性分析 （c） 以及 λ 和 p 值分布的优化

图 2.ddPCR 的分析性能。（a） 用于 LOB 测定的 60 个空白测量值的结果分布。（b） 跨浓度梯度通过 ddPCR 和 qPCR 测定的定量结果的 RSD。（C-D）qPCR （c） 和 ddPCR （d） 的 LoD95% 测定。红色实线表示概率曲线（剂量-反应规则）。红色虚线表示 95% 置信区间 （CI）。

图 3.现场样品 ddPCR 和 qPCR 检测结果的比较。（a） 维恩图包含 ddPCR 和 qPCR 检测之间的检测结果。带有 “Total” 的重叠区域表示正值，而非重叠区域表示负值。（b） ddPCR 和 qPCR 在单个阳性样品中的拷贝数分布。

抗基质干扰能力助力复杂样本分析

土壤中的腐殖酸、金属离子等成分常对核酸扩增产生抑制作用。研究表明，当向反应体系中添加土壤提取物时，qPCR 的扩增效率随提取物体积增加而显著下降，部分样本甚至完全抑制扩增；而 ddPCR 的定量偏差仍维持在 ±3.49% 以内。这种抗干扰能力源于 ddPCR 的终点检测特性 —— 即使部分微滴受抑制，未受影响的微滴仍能准确反映目标核酸含量，而 qPCR 的指数扩增过程对抑制剂更为敏感。

动态模拟与预测模型构建病害防控新范式

为揭示寄生疫霉的侵染规律，研究团队利用 COMSOL Multiphysics 软件构建有限元模型，模拟病菌从土壤向根系、茎部的扩散过程。结果显示，病菌在土壤中的负载先升后降，而根系和茎部的病菌量随病程持续增加，与田间观测的 “自下而上” 侵染模式高度吻合（R²＞0.95）。这一模拟不仅验证了 ddPCR 定量结果的可靠性，还为解析病害时空动态提供了可视化工具。

进一步结合田间气象数据（温湿度、降雨量等），研究团队建立了预测病菌负载的回归模型。模型以最小室外温度、最大室外温度、田间温度、湿度和降雨量为自变量，对茎、根、土壤样本中病菌负载的预测精度均达R²＞0.88，其中根部预测R²高达 0.985。这种将分子检测与环境因子耦合的建模方法，为基于气候数据的病害预警提供了科学依据，可指导农户在关键时期采取防控措施，优化农药施用策略。

应用前景与技术展望

该研究首次系统验证了 ddPCR 在植物病原体定量中的实用性，其无需标准曲线、抗干扰能力强的特点，使其在土壤、根际等复杂基质检测中展现出独特优势。目前，研究团队已将该技术应用于烟草黑胫病的田间监测，并计划拓展至其他土传病害如疫霉属（Phytophthora）、轮枝菌属（Verticillium）等的检测。

尽管 ddPCR 设备成本与操作门槛较高，限制了其现场大规模应用，但随着微流控技术的进步和商用平台的通量提升（如 Bio-Rad QX200 系统），该技术正逐步向基层检测实验室渗透。未来，结合机器学习优化预测模型、开发多重 ddPCR 检测试剂盒，有望构建 “分子检测 - 动态模拟 - 精准防控” 的一体化病害管理体系，为智慧农业中的植物健康监测提供核心技术支撑。

这项研究不仅为烟草黑胫病的早期诊断和量化防控提供了新工具，其方法论 —— 将绝对定量技术与生态模型结合 —— 也为其他植物病害的研究提供了可借鉴的范式，推动植物病理学研究向精准化、智能化方向发展。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.microc.2025.113865