铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一类重要的机会致病菌，可引起医院获得性肺炎、尿路感染及血流感染等严重疾病。其卓越的生存与适应能力源于多重耐药机制的叠加，包括外膜通透性降低、主动外排泵活化、β-内酰胺酶过表达及调控基因突变等，使临床治疗面临巨大挑战。近年来，碳青霉烯类（如美罗培南，MEM）和新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物（如头孢他啶-阿维巴坦，CZA）成为多重耐药P. aeruginosa的重要治疗选择。然而，耐药株及其交叉耐药现象日益增多，尤其是ampC及其调控因子ampR的关键突变（如Ω-loop区域变化），已被证实可同时导致对CZA及头孢托罗-他唑巴坦的耐药。但目前，对CZA耐药的分子机制、其与MEM之间的交叉耐药关系，以及不同菌株在适应和耐药演化过程中的差异，仍缺乏系统性研究。基于此，Bartosz J. Bartmanski等人选取来自尿液（4株）、痰液（3株）和血液（1株）的8株临床分离株，初始均对MEM和CZA敏感，进行体外进化实验：长期暴露于CZA或MEM的亚抑制浓度（1/4 MIC）下，系统追踪耐药与交叉耐药的产生过程，并结合全基因组测序（WGS）、转录组测序（RNA-seq）及蛋白质组分析（LC-MS/MS），全面解析相关的遗传变异和功能表达特征。

作者将8株临床分离的P. aeruginosa分别克隆3份，共获得24个克隆株，分别在亚抑制浓度（1/4 MIC）的CZA或MEM下连续传代18天，并定期监测MIC变化。对于18天时未达到临床耐药断点的菌株，继续传代至42天以获得耐药株。在进化实验的初始阶段和终点阶段，对菌株分别进行全基因组测序、转录组测序及蛋白质组分析，系统解析耐药进化过程中的基因变异、转录调控及蛋白丰度变化。结果显示，CZA诱导组在18天传代后，仅21%（5/24）的菌株达到CZA耐药临床断点（MIC > 8 mg/L），但38%（9/24）出现对MEM的交叉耐药，其MIC升幅相对较低——在CZA暴露条件下，MEM的MIC中位数增加约2.7倍，CZA的MIC中位数增加约3倍。延长培养至42天后，6株代表性菌株中有4株获得CZA耐药，其中2株同时表现MEM交叉耐药。相比之下，MEM诱导组在18天后有83%（20/24）的菌株达到MEM耐药断点（MIC > 8 mg/L），仅17%（4/24）出现CZA交叉耐药，但MEM的MIC升幅显著（中位数约32倍）。延长后，5株MEM暴露菌株均获高耐药（MIC > 96 mg/L），仅2株伴随CZA交叉耐药。多组学综合分析显示，dacB在CZA处理株中高频突变（4/6株），oprD在MEM处理株中特异性突变（3/5株），而ftsI在两类抗生素处理株中均出现突变（MEM组4/5株，CZA组2/6株）；转录组和蛋白组分析揭示耐药机制的显著菌株特异性与药物特异性，仅少数基因（如mexA/B、oprB等）在≥5株中共同差异表达（图1-图3）。尽管耐药机制存在高度菌株异质性，但仍需从复杂分子数据中挖掘可用于预测耐药表型的共性特征。作者通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）构建模型，基于基因表达和蛋白丰度数据区分耐药与敏感菌株，验证是否存在跨菌株的耐药预测标志物。结果显示，针对MEM和CZA的耐药性预测，蛋白质组数据模型预测准确性更高（中位数准确率0.72 vs. 转录组0.67）；还识别出与MEM、CZA耐药相关的特征基因和蛋白，为耐药机制研究提供潜在靶点。对机器学习模型筛选出的关键特征进行功能验证表明，预测MEM耐药的特征主要富集于膜转运功能相关基因（如oprD、mexB）和能量代谢相关蛋白，而预测CZA耐药的特征则与肽聚糖合成（如dacB）及β-内酰胺酶调控（如ampD）相关基因密切相关（图4-图5）。进一步，针对这些关键基因，作者展开了基因编辑、表达等试验，证实了，某些基因的突变会导致对特定抗生素的耐药性不同程度增加：dacB、mexR的突变可显著增加CZA、或/和MEM耐药性，ampC突变对CZA耐药性的影响则较轻微，而某些基因（ampD）的功能恢复（基因回补实验）可显著降低CZA MIC（表1-表2）。值得注意的是，单一基因突变不足以完全解释耐药表型，不同菌株对相同突变的耐药表现亦存在差异，提示耐药机制是多基因协同作用的结果。

综上，本研究揭示了MEM与CZA耐药及交叉耐药的差异性与复杂性：MEM更易快速诱导耐药，但产生CZA交叉耐药的概率低；CZA诱导耐药速率较低，但可促使部分菌株获得MEM交叉耐药。这提示在临床中，针对MEM耐药菌株，CZA仍可能是可行选择。研究强调了耐药机制的菌株特异性与多靶点特征，为精准用药、耐药监测及新型抗菌策略开发提供了重要参考。

图1  8株临床分离株对MEM和CZA的耐药性进化实验设计。（A）实验设计图。（B）CZA处理组对MEM和CZA的耐药性进化情况。（C）MEM处理组对MEM和CZA的耐药性进化情况。（D）CZA和MEM处理组中，对MEM和CZA耐药（MIC>8 mg/L）的菌株百分比统计。

图2  临床分离株暴露于MEM和CZA后的分子响应。（A）菌株在初始18天传代后和24-42天传代后，暴露于CZA或MEM的MIC值。（B）MEM或CZA暴露诱导的突变数量（包含单核苷酸多态性、插入、缺失和复杂重排等所有检测到的突变类型总和）。（C）与亲本菌株相比，MEM或CZA暴露诱导的差异表达基因和差异丰度蛋白数量。（D）基因本体（GO）富集分析结果（FDR≤0.05）。为可视化目的，仅展示在至少两个菌株的转录组或一个菌株的蛋白组中FDR≤0.001的GO条目。

图3  进化菌株的分子特征在很大程度上取决于亲本菌株。（A）亲本菌株及在MEM或CZA中进化的菌株的标准化转录组学和蛋白质组学数据的主成分分析（PCA）图。（B）在不同数量菌株中发生变化的差异表达转录本、差异丰度蛋白或两者共同变化的数量。

图4  机器学习模型识别可预测MEM和CZA耐药性的基因和蛋白质。（A）基于转录组学或蛋白组学数据构建的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）图，用于预测CZA或MEM耐药性。（B）用于识别预测CZA或MEM耐药性的基因和蛋白质的留一菌株法策略示意图。（C）每种组学数据类型和抗生素对应的6个留一菌株模型在留一菌株子集上的预测准确性。（D）模型选中的预测特征数量（仅考虑每个模型的前100个特征）。（E）被≥5个留一菌株模型选中的特征的基因本体（GO）富集分析，按P值排序展示每个模型的前5个GO条目。 

图5  与MEM和CZA暴露相关的关键突变、差异表达基因和差异丰度蛋白的综合分析。通过热图呈现56个关键特征在不同菌株中的分子变化模式，包括突变状态（存在/缺失）、基因表达变化（log₂倍数变化）和蛋白丰度变化（log₂倍数变化）。这些特征按功能类别分组（如青霉素结合蛋白、外排泵相关、脂多糖代谢等），筛选依据为突变分析中至少3株菌株共有的突变基因、转录组/蛋白质组差异分析中显著变化的分子，以及机器学习模型中高频出现的预测特征。热图中红色表示突变存在或表达/丰度上调，蓝色表示表达/丰度下调，白色表示未检测到突变或无数据，直观展示不同菌株对两种抗生素的分子响应差异。

表1  CRISPR-Cas9编辑的P. aeruginosa mPAO1突变体对CZA和MEM的耐药性变化

表2  临床分离株在pUCP24载体上表达ampD基因后的CZA MIC值变化

原文DOI：10.1128/mbio.03896-24