宫颈癌是全球女性健康的重大威胁，每年导致超过60万新发病例，其中80%发生在中低收入国家。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染被确认为宫颈癌的主要致病因素，特别是HPV-16和HPV-18型，这两种亚型在全球范围内约占相关病例的70%。早期诊断和干预对于改善患者预后至关重要，特别是在癌前病变阶段。然而，当前基于PCR的筛查方法存在诸多局限性：需要专业实验室环境、复杂仪器设备、精确温度控制、高昂成本以及专业技术人员操作，这使得检测结果通常需要1-2天才能获得，无形中增加了患者的额外医疗负担，影响了HPV筛查的参与度。研究表明，自我采集的宫颈样本与临床医生采集的样本在HPV检测准确性上相当，且自我采集可以克服医疗资源获取和隐私方面的障碍，在中低收入国家的社区筛查中显示出巨大潜力。因此，本研究开发了一种简便高效的HR-HPV社区筛查方法（如Figure 1所示），有助于消除宫颈癌筛查的地理和社会经济障碍，推动全球宫颈癌防控工作。

Figure 1  基于R-CHIP微流控芯片的HR-HPV筛查流程图。该筛查流程包含样本热裂解、RPA扩增和CRISPR切割检测三大核心步骤。传统PCR检测通常需6小时以上才能出具报告（上图），而R-CHIP检测体系可在1小时内完成全流程检测（下图）

技术创新与系统设计：

R-CHIP系统代表了分子诊断技术的重大突破，其结构与检测流程如Figure 2所示，它创新性地整合了四项核心技术：重组酶聚合酶扩增(RPA)、CRISPR检测、手动驱动微流控和人工智能平台。重组酶聚合酶扩增(RPA)​​技术是该系统的核心放大引擎，它能够在恒温条件下(37-42°C)快速扩增目标核酸序列，无需传统PCR所需的复杂热循环设备。研究团队针对HPV-16和HPV-18的特异性基因组区域设计了优化的引物对，通过系统评估不同引物组合的灵敏度和特异性，最终筛选出性能最佳的引物组合，实现了多重等温扩增。CRISPR-Cas12a检测系统​​提供了卓越的特异性识别能力。当Cas12a-crRNA复合物识别到目标DNA序列时，其非特异性ssDNA酶活性被激活，能够切割荧光淬灭探针TBA11，释放荧光信号。研究团队优化了Cas12a蛋白和crRNA的工作浓度(分别为60nM和80nM)，并确定20分钟为最佳检测时间，在保证信号强度的同时缩短了检测时间。手动驱动微流控芯片​​的设计是另一项关键创新。五层结构的芯片直径仅10.5cm，厚度2.2mm，包含三个平行工作单元，每个单元都配备完整的检测组件。通过巧妙设计的主动和被动阀门系统，芯片能够在低速手动操作下实现样本预处理和试剂的按需定量释放。离心力、科里奥利力和欧拉力等物理原理的精确应用，确保了液体在微通道中的精准控制。

Figure 2  R-CHIP的结构与检测流程。a) R-CHIP芯片的分层结构示意图。b) R-CHIP芯片内部各腔室分布图。c) R-CHIP芯片的手动驱动与自动化离心程序。d) R-CHIP结构部件的受力分析。e) 试剂包埋及R-CHIP中试剂释放流程示意图

系统性能与临床验证：

该R-CHIP系统在灵敏度方面表现出色。对于HPV-16和HPV-18扩增质粒，检测灵敏度分别达到惊人的10⁻¹⁷M和10⁻¹⁸M，这比传统RPA荧光方法的检测限提高了数个数量级。这种超高灵敏度主要得益于RPA和CRISPR的双重信号放大策略，以及微流控芯片提供的优化反应环境。在特异性评估中，如Figure 3所示研究团队将多重RPA-CRISPR检测系统应用于HPV九价疫苗覆盖的所有亚型以及常见阴道病原体大肠杆菌的基因序列检测。结果显示，虽然HR-HPV多重RPA检测系统与多种HPV亚型存在交叉反应，但引入CRISPR剪切步骤有效消除了非特异性信号，确保了仅对HPV-16和HPV-18的特异性识别。临床验证阶段，研究团队使用100例人宫颈细胞标本对系统性能进行了全面评估。与传统的多重PCR方法相比，R-CHIP展现出高度一致性：当HPV-16和HPV-18的阳性临界值分别设定为627.55和615.27时，一致性分别达到98%和99%。ROC曲线分析显示，系统具有优异的诊断性能(AUC>0.99)。值得注意的是，整个检测过程包括样本预处理、RPA扩增、CRISPR反应和结果读出仅需约50分钟，而传统多重PCR方法通常需要6小时以上。

Figure 3  用于高危型HPV检测的多重RPA检测设计。a) R-CHIP设计流程图。b) RPA扩增原理示意图。c) RPA扩增引物的优化。d) 高危型HPV单重RPA扩增(P16∖P18和N16∖N18分别代表添加及未添加HPV-16∖18质粒的扩增条带)。e) 高危型HPV多重RPA扩增(N表示添加H2O作为阴性对照， "ALL"表示同时添加HPV16、18质粒及引物进行的多重RPA扩增)

深度学习整合与智能分析:

R-CHIP系统的另一大创新是整合了基于深度学习的人工智能平台（如Figure 4所示），大幅提升了结果判读的效率和准确性。研究团队开发了智能手机显微成像系统，结合经典的ResNet-18预训练模型进行图像分类。通过自由组合不同荧光强度的正负样本图像，构建了包含10,976个样本的训练集和4,000个样本的验证集。在100例临床样本测试中，该模型成功将样本分为四类：阴性(N)、HPV-16、HPV-18和HPV-16+18，总体准确率达到94.0%。各类别的具体分类准确率分别为：N类100%、HPV-16类91.1%、HPV-18类93.8%、HPV-16+18类100%。模型的ROC曲线显示出优异的AUC指标，四个类别的AUC值分别为0.9931、1.0000、0.9814和0.9814，宏观平均和微观平均AUC值分别为0.9924和0.9899，表明模型具有出色的判别能力。这种智能分析系统不仅显著加快了分析过程，还实现了大规模临床样本的高效自动化分析，大大降低了结果判读对专业人员的依赖，为资源有限地区的诊断能力提升提供了创新解决方案。

Figure 4  基于深度学习的R-CHIP在HPV临床分析中的应用。a) HR-HPV诊断的R-CHIP流程示意图。b) 数据集构建方法与图像分类模型结构：通过融合不同荧光强度的阳性和阴性图像获得模拟图像，划分为训练集与验证集。使用经典ResNet-18模型将结果分为N、HPV-16、HPV-18和HPV-16+18四种类别（当输入与输出通道数不同时增加1×1卷积层）。c) 手机端部署模型的预测示意图，可通过上传照片直接读取结果。

应用前景与社会价值:

R-CHIP系统凭借其卓越性能和用户友好设计，在多个应用场景展现出巨大潜力：

​​在社区筛查方面​​，系统的便携性和操作简便性使其特别适合基层医疗机构和资源有限地区。手动驱动设计消除了对电力供应的依赖，预封装试剂减少了操作步骤，智能手机结果判读降低了专业门槛，这些特点共同使高质量HPV筛查能够真正普及到医疗资源匮乏地区。

​​在家庭自测领域​​，系统的简易操作流程(类似血糖仪的使用体验)和快速可靠的结果，为女性健康自我管理提供了新选择。研究显示，自我采样与临床采样在准确性上相当，这为居家筛查模式奠定了基础，有望显著提高筛查覆盖率，特别是对那些因隐私顾虑或就医不便而回避传统筛查的女性群体。

​​在公共卫生层面​​，R-CHIP的大规模应用可能对全球宫颈癌防控格局产生深远影响。据估算，这项技术每年可能帮助预防数十万例宫颈癌发生，特别是在高负担的中低收入国家。系统的低成本特性(相比传统PCR)和可扩展性，使其成为实现WHO消除宫颈癌全球战略的有力工具。

​​技术扩展性方面​​，R-CHIP的模块化设计允许通过更换预装crRNA轻松适应其他病原体检测。这种灵活的平台技术可快速应用于传染病监测(如HIV、HPV、结核等)、癌症早期预警标志物筛查、乃至抗生素耐药性评估等多个领域，展现出广泛的适用前景。

原文doi: https://doi.org/10.1002/advs.202414918