CRISPR+纳米金：肉眼可辨的致病菌“快速检测仪”

原创

来源：邹晶晶

2025-08-22 15:32:06

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核心提示：近日，来自《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》的一项研究展示了一种新型CRISPR/Cas12a-金纳米颗粒比色传感器。该传感器以“OFF to ON”模式，2小时内实现铜绿假单胞菌可视化检测，检测限低至1 CFU/反应，为资源有限场景的感染快速诊断提供新工具。

致病菌如铜绿假单胞菌因其多重耐药性和引发严重感染的特性，对公共健康构成重大威胁，亟需快速可靠的检测方法，尤其在资源有限环境中。传统核酸检测依赖CRISPR/Cas系统的转切活性，虽催生出SHERLOCK、DETECTR等平台，但多基于荧光淬灭-恢复原理，存在操作复杂、设备昂贵、信号稳定性差等问题，限制了现场应用。比色检测因设备简单、操作便捷、结果可视化等优势，成为替代方案的优选。金纳米颗粒（AuNPs）凭借表面等离子体共振效应，在DNA功能化后可通过杂交反应产生明显颜色变化，非常适合快速现场检测。基于此，温州医科大学楼永良团队创新性构建了CRISPR/Cas12a介导的AuNPs比色生物传感器，采用“OFF to ON”信号模式：无目标时，由生物素修饰的捕获-阻断DNA复合物（cbDNA）抑制clDNA功能化的AuNPs（clDNA-AuNPs）与链霉亲和素包被的96孔板（SA-plate）结合，反应板无色；目标存在时，Cas12a部分切割cbDNA，产生左端短单链DNA片段（lDNA），这些lDNA与clDNA-AuNPs杂交，使板呈红色（图1）。

该生物传感器对铜绿假单胞菌的检测限低至1 CFU/反应，且在2小时内即可完成检测。特异性测试中，对包括鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、B 组链球菌、表皮葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌在内的6种非目标菌株无交叉反应，仅对12株铜绿假单胞菌临床分离株产生特异性信号。而且，该传感器具备较强的抗干扰能力，在痰和血液等复杂临床样本中，加标样本与未加标样本的吸光度差异显著（p<0.05），证实其在复杂基质中的稳定性（图2）。临床验证更显示，对32份血液样本（13份阳性、19份阴性）检测的ROC曲线下面积（AUC）达1，实现完美诊断区分（图3）。

总的来说，这项基于CRISPR/Cas12a与AuNPs的比色生物传感器研究，成功融合了CRISPR系统的高特异性与金纳米颗粒的可视化优势，且其采用不同于以往“ON to OFF”模式的“OFF to ON”信号转换策略，不仅提升了检测信号的直观性，还改善了信号稳定性。这种无需复杂仪器、操作简便的检测平台，尤其适用于资源有限的现场检测场景，为感染性疾病的快速诊断和防控提供了新的技术手段，也为其他致病菌的检测提供了可借鉴的研究范式。然而，该研究也存在一定局限性。目前该生物传感器的检测流程依赖PCR进行预扩增步骤，这不仅增加了复杂性和成本，还因需要热循环仪而限制了在即时检测场景中的可及性。未来，若能整合等温扩增技术（如重组酶聚合酶扩增RPA）来替代PCR，将有望进一步提升该生物传感器的便携性和检测效率，使其在临床和现场检测等领域发挥更大的作用。

图1 CRISPR/Cas12a介导的金纳米颗粒比色检测原理示意图。（A）检测机制示意图：展示了在有无目标DNA时的信号变化过程。当存在目标DNA时，Cas12a切割cbDNA产生lDNA，lDNA与clDNA-AuNPs杂交，使SA-plate呈现红色；无目标DNA时，完整的cbDNA抑制杂交，板保持无色。（B）SEM图像：对比了阴性对照组（无目标DNA）和阳性对照组（有目标DNA）的颗粒分布，阳性组板上可见大量颗粒聚集，阴性组颗粒极少。（C）通过设计不同实验条件的对比：阴性对照、生物素覆盖的板、低浓度cbDNA（0.16 μM）及阳性对照，以确认体系的特异性：仅目标DNA存在时，会出现阳性信号，而不受生物素和cbDNA带来的空间位阻干扰，验证CRISPR/Cas12a切割cbDNA后介导clDNA-AuNPs产生信号的核心机制，确认检测方法的可靠性。

图2 铜绿假单胞菌检测的分析性能评估。（A）检测灵敏度结果：展示了不同浓度铜绿假单胞菌（从10⁰到10⁶ CFU/反应）的检测信号。随着细菌浓度升高，吸光度逐渐增加，即使低至10⁰ CFU/反应的浓度，也能通过吸光度变化和可见颜色变化与无模板对照组（NTC）区分，表明该方法具有高灵敏度。（B）特异性分析结果：对比了6种非铜绿假单胞菌菌株和12株铜绿假单胞菌临床分离株的检测信号。结果显示铜绿假单胞菌临床分离株的吸光度显著高于非目标菌株，无明显交叉反应，且颜色变化清晰，证实该方法特异性良好。（C）复杂样本适用性验证：在加标临床样本（痰和血液）中测试方法性能。与未加标对照组（阴性痰样本1–3、阴性血液样本4–6）相比，加标阳性样本（阳性痰样本7–9、阳性血液样本10–12）的吸光度显著升高（p<0.05），且颜色变化明显，表明该方法在复杂临床基质中仍能有效检测目标菌，具有实际应用潜力。

图3 铜绿假单胞菌检测的临床样本验证结果图。（A）临床血液样本检测结果：对19份阴性临床血液样本和13份阳性临床血液样本的吸光度（530 nm）进行对比，阳性样本的吸光度显著高于阴性样本（T检验，p<0.05）。插图展示了对应样本的比色结果，阳性样本反应板呈红色，阴性样本呈无色，直观验证了检测信号差异。（B）样本吸光度散点图：通过散点图清晰呈现阴性组和阳性组样本的吸光度分布，两组数据无重叠，显示出明显的区分度，进一步证实检测结果的可靠性。（C）ROC曲线分析结果：该生物传感器的诊断准确性极佳，曲线下面积（AUC）为1，表明其能完美区分阳性和阴性样本，具有极高的临床诊断价值。