一管操作，20分钟，1微升样本：PCA技术实现蛋白质快速检测

研究背景 

传统的蛋白质检测方法（如ELISA、化学免疫发光法、LC-MS等）通常需要多步操作、较长反应时间、较大样本量以及复杂设备，限制了其在即时检测（POCT）和家庭自测中的应用。尤其是面对突发公共卫生事件，快速、灵敏、便捷的检测手段显得尤为重要。

尽管已有一些基于核酸信号放大的方法（如RCA、HCR、SDA等）试图解决这些问题，但它们大多依赖模板扩增，易污染，且反应步骤繁多。近年来发展的邻近策略（如基于核酸酶的 proximity assays）虽然避免了扩增，但仍存在反应时间长、操作复杂等问题。在本研究中，邹秉杰研究员团队提出了一种邻近切割测定技术（PCA技术），通过靶标诱导的DNA探针邻近触发的级联酶切割反应克服了上述限制。

研究原理

PCA技术的核心在于目标蛋白诱导的DNA探针邻近效应，触发FEN1酶介导的级联切割反应，实现信号放大。具体步骤如下：

1. 探针结合：一对带有DNA标签的亲和配体（如抗体或抗原）同时结合目标蛋白，使其DNA尾部因邻近效应而杂交。

2. 结构形成：引入的“悬垂探针（OP）”与杂交后的DNA形成三链重叠结构，FEN1酶识别并切割OP，释放5′端片段。

3. 信号放大：释放的片段与FRET探针结合，再次形成可被FEN1识别的结构，触发第二轮切割，释放荧光信号。

4. 循环放大：由于OP和FRET探针过量，该过程可循环进行，实现信号放大。

整个过程在一管中进行，只需加入样本并混匀，无需任何洗涤或分离步骤。

图1：PCA工作原理示意图

研究结果 

1.链霉亲和素检测 

研究人员首先以链霉亲和素为模型蛋白验证PCA可行性。结果显示，仅在目标存在时才能观察到明显的荧光信号和切割条带（UreaPAGE），背景信号极低。

图2：链霉亲和素检测可行性

2 条件优化 

通过系统优化探针互补长度、温度、酶浓度等参数，确定了最佳反应条件，使检测灵敏度达到4 pM。

3 抗体与抗原检测 

研究进一步将PCA应用于抗SARSCoV2刺突蛋白抗体和SARSCoV2刺突蛋白的检测：

- 抗体检测：在10–1000 pM范围内呈良好线性，LOD为7 pM，回收率88–108%。

- 抗原检测：同样在10–1000 pM范围内线性良好，LOD为7 pM，回收率85–109%，且与商业抗原快速检测试剂盒（ARTK）结果一致。

图3：抗体检测性能

图4：抗原检测性能与可视化

4 选择性与临床验证 

PCA对非目标蛋白（如其他冠状病毒蛋白或无关抗体）表现出高选择性。临床样本检测结果与ARTK完全一致，显示其具备实际应用潜力。

图5：临床样本检测一致性

5 可视化检测 

研究人员还展示了在470 nm LED灯下通过肉眼即可判断结果，最低可视浓度为25 pM，极大提升了其在家用检测中的适用性。

效果及展望 

PCA技术具有以下突出优势：1、极简操作：一管反应，无需洗涤，适合非专业人员使用；2、快速灵敏：20分钟内完成检测，灵敏度达pM级别；3、样本量少：仅需1 μL生物液体（血清、唾液等）；4、设备无关：可通过荧光仪读取结果，适合资源有限地区。未来可通过更换探针适配不同 biomarker，具备广泛的应用前景。

PCA不仅适用于SAES-CoV-2突刺蛋白检测，还可扩展至其他传染病、癌症标志物、心血管疾病等多个领域。其模块化和便携性特点使其成为未来个性化医疗和家庭健康监测的重要工具。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117864