新冠疫情暴发后，SARS-CoV-2与流感症状重叠、传播途径相似，极易误诊并加剧社会恐慌，因此急需能一次筛查多种呼吸道病毒的高灵敏方法。现有RT-qPCR虽灵敏，却依赖昂贵设备、专业人员和漫长流程，且无法区分活毒与死毒；传统ELISA等免疫法则因灵敏度有限，难以发现早期低载量样本。为此，研究者把目光投向“将蛋白信号转化为核酸信号”的策略，其中滚环扩增（RCA）因可在恒温下指数级放大，被认为最具现场应用潜力。然而，当前RCA方案多为单病毒检测，无法满足COVID-19与流感并行的多重需求。悬浮条形码技术为实现多重检测提供了新思路：与平面芯片相比，悬浮微球反应更快、通量更高。在各类编码材料中，光子晶体（PhC）凭借结构色稳定、无荧光漂白等优势脱颖而出，却普遍依赖荧光标记探针，制备复杂且成本高。基于此，南京大学李智洋团队首次提出了“核-壳PhC条形码＋RCA无标记放大”的组合策略：以SiO₂光子晶体为颜色编码核心，外层包覆多孔水凝胶，形成核-壳结构光子晶体；然后，在其多孔水凝胶外壳上共价固定一条起“锚”作用的核酸探针；随后，将两条分别标记了互补DNA序列的抗体（Ab-1与Ab-2）与样本混合。当目标病毒蛋白出现时，这对抗体以“夹心”方式精准包被抗原，使两条DNA链因空间邻近而瞬时杂交，释放出被锁定的RCA引物。引物随即与微球表面的锚定探针结合，触发RCA，生成大量G-四链体并与ThT染料结合，产生与病毒浓度成线性关系的荧光信号（图1）。不同颜色的光子晶体微球分别对应不同病毒靶标，从而在单管中即可同时、快速、超灵敏地定量H1N1、SARS-CoV-2-S和SARS-CoV-2-N，为现场多重呼吸道病原体筛查提供了全新解决方案。

研究通过设计不同粒径的光子晶体，改变其晶格常数，从而精确调控结构色的反射峰位，成功制备出蓝、绿、红三种互不重叠的光学条形码。随后，以这些光子晶体微球为核心，依次进行水凝胶灌注、紫外固化及选择性刻蚀，构建出具有多孔外壳的核-壳结构。多孔水凝胶层不仅提供了丰富的羧基位点用于共价固定氨基修饰的核酸探针，还保持了光子晶体核心的光学特性，使颜色编码在后续生物功能化过程中稳定不变（图2）。所建立的方法分别以蓝、绿、红三色核-壳微球依次携带H1N1、SARS-CoV-2-S和 SARS-CoV-2-N特异性探针，继而在同一反应体系中实现在单荧光通道内完成三种病毒的同步定量检测，线性范围为1–50 pg/mL，检测限低至0.3 pg/mL，且对高浓度干扰蛋白无明显交叉反应（图3）。临床咽拭子掺毒实验显示三种病毒回收率89.6–114.1%，与商用ELISA结果一致，证明该体系在单荧光通道条件下即可实现无标记、高特异、多重病毒定量。至此，体系在“单荧光通道+颜色编码”策略下，实现了一次加样、多重定量、结果可视化的全流程验证。

总的来说，本研究首创“核-壳光子晶体条形码＋滚环扩增”一体化策略，以结构色微球作身份标签，以抗体-DNA邻近触发放大，实现零标记、单通道、多病毒同步定量。平台将蛋白信号转化为核酸级联荧光，灵敏度优于传统免疫法，且流程简省，适合现场筛查。临床样本验证显示结果与金标准一致，凸显实用价值。然而，当前探针组合有限，若需覆盖更多病原体须重新设计并优化反应体系；微球制备批间差异、RCA试剂稳定性及长期储存条件在资源受限场景下仍需进一步考察。

图1  无标记免疫检测平台示意图：基于RCA的核-壳结构色条形码用于多重病毒检测

图2  三色核-壳光子晶体条形码的宏观颜色与反射光谱表征。（a-c）光学照片：展示三种不同粒径SiO₂自组装光子晶体微球的宏观结构色（蓝、绿、红），标尺200 µm。（d-f）明场显微照片：对应微球经水凝胶包覆并刻蚀后仍保持鲜明颜色，证实核-壳结构未破坏原始结构色。（g-i）反射光谱：三条曲线分别对应蓝、绿、红微球的反射峰位（约470、550、635 nm）；包覆前后反射峰位置几乎不变，证明水凝胶外壳对光子晶体光学性质影响极小，可用于多重编码。

图3  灵敏度与特异性评价：三种病毒蛋白的梯度检测及干扰实验。（a-c）荧光强度柱状图：分别展示H1N1、SARS-CoV-2-N和SARS-CoV-2-S在1–100 pg/mL范围内的梯度检测结果，信号随浓度增加而增强。（d-f）线性拟合曲线：三种病毒在1–50 pg/mL范围内呈良好线性（R²>0.99），据此计算出LOD均为0.3 pg/mL（S/N=3）。（g-i）特异性测试：在500 pg/mL的干扰蛋白（BSA、H3N2等）存在下，只有目标病毒能引起显著荧光升高，证明平台具有高特异性（交叉反应可忽略）。所有实验重复3次。

 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.117037