研究背景

食源性病原体是全球食品安全和公共健康的重大威胁。其中，沙门氏菌是最常见的致病菌之一，每年导致数百万人感染，数万人死亡。传统的检测方法如平板培养、ELISA和PCR等，虽然各有优势，但存在操作繁琐、耗时长、成本高、依赖专业设备等局限性。

近年来，Argonaute蛋白（Agos） 因其具有程序化的核酸识别与切割能力、单碱基分辨率和无需PAM序列等优势，成为新兴的分子诊断工具。尤其是来自超嗜热古菌的 PfAgo，具有更高的切割效率和热稳定性，被广泛用于构建高特异性生物传感器。

然而，现有的PfAgo传感器多依赖荧光信号输出，存在背景干扰大、设备依赖性强等问题。因此，开发一种无需复杂仪器、可实现可视化读出的PfAgo传感器具有重要的实际意义。

研究原理

研究设计的 AgoZyme biosensor 融合了以下三个核心模块：

a. PfAgo系统：

使用三条5'磷酸化引导DNA（gDNA）识别目标DNA（invA基因扩增产物）；PfAgo激活后对 linker ssDNA 进行特异性切割。

b. 磁性捕获探针与纳米酶信号探针：

- 捕获探针：链霉亲和素修饰的磁珠（MBs）连接生物素化ssDNA；

- 信号探针：Hemin@ZIF90纳米酶表面修饰ssDNA，具备类过氧化物酶活性。

c. “夹心式”检测结构与信号输出：

- 若目标存在 → PfAgo切割linker → 无法形成“MB–linker–纳米酶”复合物 → 纳米酶留在上清液中 → 催化TMB–H₂O₂显色（蓝色）；

- 若目标不存在 → linker完整 → 纳米酶被磁珠捕获 → 上清液中无纳米酶 → 无显色反应。

图1: AgoZyme生物传感器原理图

研究结果

a. Hemin@ZIF90纳米酶的合成与表征

- 通过Zn²⁺与2ICA配位自组装，将hemin封装于ZIF90孔道中；

- SEM/TEM显示其为约200 nm的十二面体结构；

- UVvis、XRD、FTIR、XPS等证实hemin成功嵌入ZIF90框架中。

图2: Hemin@ZIF90的合成与表征

b. Hemin@ZIF90的类酶活性与稳定性

- 表现出优异的类过氧化物酶活性，可催化TMB显色；

- K_m值为0.635 mM，与天然HRP相当，V_max更高；

- 在90°C高温下仍保持83%活性，室温储存30天后活性保留91%，远优于HRP。

图3: Hemin@ZIF90的催化性能与稳定性

c. AgoZyme传感器的构建与性能验证

通过凝胶电泳、荧光信号等多方法验证了PfAgo切割活性、探针连接有效性；在最优条件下，检测限达1 CFU/mL，线性范围达10¹–10⁸ CFU/mL；并且对6种常见食源性致病菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等）均无交叉反应，表现出高特异性。

图4: 灵敏度与选择性分析

d. 实际样品检测验证

在牛奶、鸡肉、鸡蛋、饮用水等真实样品中进行加标回收实验：回收率在86%–119%之间，变异系数（CV）低于10%；与qPCR方法结果一致，验证了其在实际应用中的准确性与可靠性。

总结及展望

在这项工作中，提出了一种将MOF纳米酶与PfAgo技术相结合的创新病原体检测平台。通过整合具有优异POD样活性的Hemin@ZIF-90和具有优异性识别和切割能力的PfAgo，该AgoZyme生物传感器实现了对鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏度和特异性检测。该生物传感器具有1- 10⁸ CFU/mL的宽线性范围，并且LOD低至1 CFU/mL。此外，所提出的生物传感器可以应用于回收率令人满意的食品样品（86 %–119 %）。通过替代靶点识别序列和ssDNA连接子序列，所提出的AgoZyme生物传感器可以实现对不同病原体的通用检测。本研究不仅克服了PfAgo系统对荧光信号读出方法的依赖性，而且为基于PfAgo的生物传感器检测其他食品病原体的设计和开发提供了新的见解。

原文链接: 10.1016/j.foodchem.2025.145952