1.引言

食品安全是全球关注的热点问题，许多食源性疾病由各种病原体引起，具有高发病率。传统细菌检测方法如培养平板法、ELISA和PCR虽然有效，但存在检测时间长、灵敏度低、操作复杂等局限性。因此，开发简单、快速、灵敏的检测方法成为迫切需求。近年来，微流控芯片和重组酶辅助扩增技术（RAA）等新兴技术因具有操作简单、响应快速、灵敏度高等优点，在细菌检测中受到广泛关注。

本研究开发了一种基于手指驱动微流控芯片和重组酶辅助扩增技术（RAA）的多重细菌检测技术。通过制备包含气压驱动室、菱形室、蛇形通道、旋转阀、废液室和圆柱形反应室的微流控芯片，以及配备3D打印支架和排斥磁铁的磁性场，实现了样品的自动化处理。目标细菌（沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和李斯特菌）的DNA通过优化后的裂解、提取和扩增条件，在便携式荧光检测装置下进行定量分析。该技术解决了传统检测方法中检测时间长、灵敏度低、操作复杂等问题，可在45分钟内检测到低至15 CFU/mL的沙门氏菌、48 CFU/mL的大肠杆菌O157:H7和38 CFU/mL的李斯特菌，具有良好的特异性和实用性，适用于现场筛查食源性病原体。

图 1 该手指驱动微流控芯片用于多重细菌检测的方案。（A）微流控芯片的设计;（B）微流控芯片的结构;（C-D）细菌检测的程序和方法;（E） 便携式设备的设计。

2.结果与讨论

验证气动止回阀：验证了气动止回阀的单向流体控制性能，通过比较不同直径铁球（1.5mm、1.6mm和1.7mm）的密封性能，发现1.7mm铁球的密封性能最佳。此外，展示了洗脱的DNA模板在连续检测室中的等量和不等量分布情况。

图 2 气动止回阀的验证。（A）指驱动气动止回阀的机构;（B-C）不同直径铁球（1.5 mm、1.6 mm 和 1.7 mm）的比较（N = 3）;（D）洗脱的DNA模板在串行检测室中的相等和不均匀分布。

验证DNA纯化：验证了DNA纯化过程中的高梯度磁场和磁珠捕获效率，通过模拟和实验比较，高梯度磁场比永磁体具有更高的磁场强度和梯度，能够更有效地捕获磁珠。优化了洗脱时间，确定10分钟为最佳洗脱时间，回收率达到84%。

图 3 DNA 纯化验证。（A）使用有限元机软件模拟高梯度磁场和永磁体;（B）（a）高梯度磁场和（b）永磁体下磁珠在通道中的分布;（C）对磁珠不同时间洗涤后收集的溶液的吸光度（N = 3）;（D）不同洗脱时间的DNA回收率（N = 3）。

细菌裂解方法和RAA反应条件的优化：优化了细菌裂解方法和RAA反应条件，确定了核酸释放剂为最佳裂解方法，并在25°C至35°C范围内裂解效果良好。最佳扩增温度为39°C，扩增时间为25分钟，引物体积为2.0μL，探针体积为0.9μL。

图 4裂解扩增方法的优化。（A）不同裂解方法的比较（N = 3）;（B）不同裂解温度（20°C、25°C、30°C和35°C）的比较（N = 3）;（C）放大温度（37°C、39°C、41°C和43°C）的比较（N=3）;（D）扩增时间（10 min、15 min、20 min、25 min和30 min）和引物体积（1.5 μL、2.0 μL、2.5 μL和3.0 μL）的比较（N = 3）;（E）探针体积（0.3 μL、0.6 μL、0.9 μL、1.2 μL和1.5 μL）的比较（N = 3）。

芯片的性能评估：在最佳条件下，芯片能够检测到低至15 CFU/mL的沙门氏菌、48 CFU/mL的大肠杆菌O157:H7和38 CFU/mL的单核细胞增生李斯特菌。芯片的特异性良好，目标细菌的G值明显高于非目标细菌。此外，芯片在实际鸡肉样品中的检测性能与qPCR相似，展示了良好的实用性。

图 5该芯片在多重细菌检测方面的性能。（A/C/E）三种细菌（鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157：H7）在最佳条件下的荧光强度（N = 3）;（前/深/楼）三种细菌（鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157：H7）的校准模型（N = 3）;（G）该芯片的特异性（N = 3）;（H）芯片和qPCR检测多种细菌（N = 3）的比较。

3.总结

本文介绍了一种基于手指驱动微流控芯片和重组酶辅助扩增（RAA）的多重细菌快速检测技术。该技术通过集成气动止回阀和旋转阀，实现了样品加载、DNA提取、扩增和检测的全过程一体化，具有操作简便、灵敏度高、检测时间短等优点。在最佳条件下，该芯片能够在45分钟内检测到低至15 CFU/mL的沙门氏菌、48 CFU/mL的大肠杆菌O157:H7和38 CFU/mL的单核细胞增生李斯特菌。此外，该芯片在实际鸡肉样品中的检测性能与qPCR相似，展示了良好的实用性。该研究为食源性病原体的现场筛查和食品安全增强提供了潜在的技术支持。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117750