1.引言

 清洁水资源对公共健康和社会经济可持续发展意义重大，但人口增长、城市化及工业化加剧了水污染，其中微生物污染会带来健康风险，因此高效检测水中微生物污染十分关键。

传统检测方法（如平板计数法）应用广泛，但耗时费力，还可能因无法检测 “活的非可培养微生物” 而低估数量；新兴的 PCR、FCM、ATP 生物发光法虽有优势，却分别存在难区分活菌死菌、成本高、易受干扰的问题。

荧光光谱技术快速且无创，在微生物检测中前景广阔 —— 活细菌的内源性荧光团可作 “识别标记”。不过早期研究多为定性，近年定量研究也多基于单一波长；而 EEM（三维荧光光谱）能提供更丰富信息，FRI（荧光区域积分法）虽可分析 EEM，却极少用于细菌荧光表征。

本研究先将细菌内源性荧光团分为 A 区（氨基酸）、N 区（还原辅酶）、F 区（黄素）三大区域，明确各区域对应荧光物质；再分析 4 种纯菌株（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌）及两座再生水厂二级出水中土著细菌的荧光特性；接着验证荧光积分值与细菌浓度的相关性，并用 PCA（主成分分析）区分不同菌种及实际水体中的细菌；最终旨在建立一套快速可靠的水中细菌检测与定量方法，解决传统方法耗时、操作复杂的问题。

2.结果与讨论

基于细菌内源性荧光团的光谱特性，相较于此前的 5 个 EEM 区域，扩大了激发与发射波长范围，新增 N 区和 F 区以精准捕捉辅酶类荧光信号，更贴合细菌自体荧光的实际特征，为后续通过荧光区域积分（FRI）定量分析细菌荧光奠定了分类基础，有利于为后续通过荧光区域积分（FRI）定量分析细菌荧光奠定了分类基础.

    图1. 细菌内源荧光团的EEM区域。A 区：对应氨基酸（包含酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），激发波长 200-300nm、发射波长 250-400nm；N 区：对应 NAD (P) H（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其磷酸酯），激发波长 300-400nm、发射波长 400-500nm；F 区：对应黄素（如黄素腺嘌呤二核苷酸 FAD），激发波长 400-500nm、发射波长 500-600nm。

荧光强度分布：四种细菌强荧光均集中于 A 区（氨基酸），N、F 区荧光弱，印证氨基酸是细菌自体荧光主来源，与细菌以蛋白质为主要成分、辅酶含量低的生理特征一致。

A 区荧光特征：四种细菌在 A 区均呈双荧光峰（激发波长约 230nm 和 280nm，发射波长约 330nm），与标准色氨酸双峰特征吻合，可作为细菌存在的定性依据。

菌种差异：革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）A 区荧光强于革兰氏阴性菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌），推测与细胞壁结构差异导致的蛋白质含量不同有关；枯草芽孢杆菌浓度虽低，但 A 区荧光与其他菌相当，或因其胞外聚合物（EPS）中蛋白质贡献额外荧光；铜绿假单胞菌 N 区荧光较强，源于其 EPS 中的铁载体绿脓素。

图2. 四种典型细菌的 EEM 轮廓图。(a)枯草芽孢杆菌（8×10⁴CFU/ml）、(b)金黄色葡萄球菌（1.65×10⁷CFU/ml）、(c)大肠杆菌（4.3×10⁷CFU/ml）、(d)铜绿假单胞菌（2.75×10⁷CFU/ml）四种细菌的 EEM 轮廓，横轴为发射波长（200-600nm），纵轴为激发波长（200-500nm），标注了 A 区、N 区、F 区的位置及荧光强度分布（以不同灰度或颜色梯度表示）。

整体趋势：随细菌浓度升高，A、N、F 三区荧光积分值均上升；除铜绿假单胞菌外，A 区荧光积分比 N、F 区高 1-2 个数量级，与图 2 中 A 区强荧光结果一致。

定量相关性：四种细菌 F 区荧光积分与浓度的 R² 均超 0.9，线性关系优，可作为细菌定量可靠指标；A 区易受有机物荧光干扰，N 区线性相关性不稳定，均不适用于定量。

检测限差异：基于 F 区的检测限因菌种而异，枯草芽孢杆菌低至 10CFU/ml，大肠杆菌需超 10⁶CFU/ml，差异与菌种黄素含量及代谢状态有关，需针对性优化检测条件