伏马菌素B₁（FB₁）是由镰刀菌产生的高毒性霉菌毒素，具有免疫毒性、神经毒性、肝毒性和肾毒性，稳定性强，常规加工难以去除，常污染玉米、小麦等农产品及其加工品，通过食物链进入人体，可诱发食管癌、肝癌等疾病，被国际癌症研究机构列为2B类可能致癌物。

现有检测方法中，高效液相色谱（HPLC）虽准确但操作复杂、耗时久；酶联免疫吸附试验（ELISA）特异性较好，但抗体昂贵且稳定性差。适配体因其高亲和力、易合成修饰等优势在传感领域受关注，但现有适配体传感器灵敏度仍需提升。

Argonaute蛋白（如TtAgo）作为可编程核酸内切酶，无需PAM序列，可通过短链DNA引导切割靶标，与熵驱动催化（EDC）结合可增强信号放大。荧光单颗粒检测灵敏度高，但传统计数方法效率低。为此，本研究结合EDC-TtAgo级联放大与YOLOv9深度学习计数，构建超灵敏FB₁检测平台。

方案1.深度学习辅助荧光单粒子检测FB1的检测原理

研究内容

图1.截断FB1适配体。

通过分子对接指导截短原始80nt的FB₁适配体（FB-80），经ITC和SGI荧光法评估结合亲和力。截短得到的FB-57与FB₁结合位点更优，Kd值（ITC：6.7±4.8μM；SGI：7.92±1.22nM）低于FB-69和FB-38，亲和力更高。圆二色谱（CD）显示FB-57与FB₁结合后构象变化，证实相互作用。FB-57因高亲和力和低成本被选为最优适配体。

图2.RFEMs的合成与表征。

采用溶胀-扩散法将AIE染料（TPETPAFN）嵌入聚苯乙烯（PS）微球制备RFEMs。SEM显示其形态均一、分散性好，与空白PS微球尺寸接近（约4.5-5μm）。RFEMs在日光下呈粉色，365nm紫外灯下发出亮橙红色荧光，FT-IR证实表面氨基保留，利于DNA功能化。荧光稳定性实验表明其在不同pH、温度下及储存过程中性能稳定，单颗粒成像显示高信噪比，适合作为信号探针。

图3.验证了该方法的可行性。

PAGE实验证实FB-57与FB₁结合后释放触发序列（T），启动EDC循环：T通过链置换反应解离底物释放输出序列（O），且T可循环利用，生成大量O。O作为5'-磷酸化向导DNA激活TtAgo，在Mn²⁺存在下切割信号探针（RFEMs-ssDNA-生物素）。荧光报告实验显示，FB₁存在时荧光信号显著增强，且EDC-TtAgo级联放大效果优于单一TtAgo。单颗粒成像验证最终上清液中荧光微球数量随FB₁浓度增加而增多，证实检测体系可行性。

图4.深度学习辅助荧光单颗粒计数

采用YOLOv9模型对荧光图像中的红色颗粒自动计数，经300轮训练后，精度、召回率和mAP曲线稳定，对低/高浓度RFEMs均能准确识别。与传统方法（ImageJ、findContour、人工计数）相比，YOLOv9在颗粒重叠时仍保持高准确性，单图处理仅需20ms，可批量处理，且与人工计数结果高度相关（R²=0.999），大幅提升分析效率。

图5.分析性能。

在优化条件下，FB₁浓度0.001-100ng/mL范围内，荧光颗粒计数与浓度呈良好线性（R²=0.994），检测限0.89pg/mL。特异性实验显示，10倍浓度的其他霉菌毒素（OTA、AFB₁等）对信号影响极小。玉米和植物基肉类似物加标实验回收率87.2%-113.5%，RSD5.6%-10.9%，与HPLC-MS/MS结果一致，证实方法实用性。

 本研究构建的深度学习辅助荧光单颗粒适配体传感平台，通过分子对接优化适配体（FB-57）提升亲和力，结合EDC-TtAgo级联放大增强信号，利用YOLOv9实现快速精准计数，对FB₁检测限达0.89pg/mL，线性范围宽，特异性强。实际样品检测回收率理想，与HPLC-MS/MS结果一致。该平台拓展了Argonaute的应用范围，解决了传统单颗粒计数效率低的问题，虽存在操作步骤较复杂等不足，但为食品安全中痕量霉菌毒素检测提供了高效可靠的新方法，具有良好应用前景。

 原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c05913