1.引言

沙门氏菌是一种重要的食源性病原体，对全球公共健康安全构成严重威胁。传统的检测方法如平板计数、酶联免疫吸附测定（ELISA）和聚合酶链反应（PCR）在检测活菌和死菌方面存在局限性，无法准确区分沙门氏菌的活性状态。因此，开发一种能够同时检测食品样本中总菌、活菌和死菌的高灵敏度检测平台，对于精确控制食品污染和预防疾病爆发具有重要意义。

本研究开发了一种集成表面增强拉曼光谱（SERS）与三磷酸腺苷-生物发光（ATP-BL）的双模免疫生物传感器技术。通过合成ConA-Fe₃O₄@AuNPs捕获探针和Apt-Au@PB@Au@AgNPs信号探针的方法，形成了一种可磁分离的“三明治”复合结构。该技术能够产生高强度的SERS信号以量化总沙门氏菌数量，并通过光热裂解触发ATP释放，从而通过BL信号响应活沙门氏菌的数量。这种方法解决了传统检测方法无法同时准确区分活菌和死菌的问题，实现了高灵敏度（检测限低至8.56 CFU/mL活菌和4.99 CFU/mL总菌）、高特异性检测，并在2.5小时内完成检测，为食品中沙门氏菌的精准控制和污染预防提供了新的解决方案。

图 1 SERS/ATP-BL 双峰生物传感器形成示意图（A）捕获探针的制备过程;（B）信号探头的制造工艺;（C）检测原理。

2.结果与讨论

Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄@AuNPs和ConA-Fe₃O₄@AuNPs的TEM图像和表征：通过透射电子显微镜（TEM）观察了Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄@AuNPs和ConA-Fe₃O₄@AuNPs的形态，发现这些纳米颗粒呈球形，分散良好，尺寸均匀。Fe₃O₄NPs的直径为11.82±0.84 nm，Fe₃O₄@AuNPs的直径为35.09±0.27 nm，ConA修饰后表面出现薄膜状层。此外，通过Zeta电位、UV-vis光谱、FTIR光谱、XRD和XPS等表征手段，确认了ConA成功修饰在Fe₃O₄@AuNPs表面，且这些纳米材料具有良好的磁响应性。

图 2 Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄@AuNPs和ConA-Fe₃O₄@AuNPs的TEM图像和表征：A：Fe₃O₄NPs的TEM图像。 B：Fe₃O₄@AuNPs的TEM图像。 C：ConA-Fe₃O₄@AuNPs的TEM图像。 D：Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄@AuNPs和ConA-Fe₃O₄@AuNPs的尺寸分布图。 E：Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄-PEI NPs、Fe₃O₄@AuNPs、NH₂-Fe₃O₄@AuNPs和ConA-Fe₃O₄@AuNPs的Zeta电位图。 F：Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄-PEI NPs和Fe₃O₄@AuNPs的UV-vis光谱图。G：Fe₃O₄NPs和Fe₃O₄@AuNPs的FTIR光谱图。 H：Fe₃O₄NPs和Fe₃O₄@AuNPs的XRD图谱。 I：Fe₃O₄NPs和Fe₃O₄@AuNPs的XPS图谱。 J：Fe₃O₄NPs和Fe₃O₄@AuNPs的VSM曲线。 K：Fe₃O₄@AuNPs和Fe₃O₄NPs的磁性分离测试。

验证了AuNPs、Au@PBNPs、Au@PB@AuNPs和Au@PB@Au@AgNPs的TEM图像和表征：通过TEM观察了AuNPs、Au@PBNPs、Au@PB@AuNPs和Au@PB@Au@AgNPs的形态，发现这些纳米颗粒分散良好，尺寸均匀，Au@PB@Au@AgNPs的直径为68.26±0.48 nm。EDS元素映射分析证实了C、N、Fe、Au和Ag元素在结构中的成功掺入和分布。UV-vis光谱和Zeta电位分析表明，随着层层包覆，纳米颗粒的SPR峰发生红移，最终Au@PB@Au@AgNPs表现出良好的稳定性和SERS信号增强效果。

图 3 AuNPs、Au@PBNPs、Au@PB@AuNPs和Au@PB@Au@AgNPs的TEM图像和表征： A1：AuNPs的TEM图像。 A2：Au@PBNPs的TEM图像。 A3：Au@PB@AuNPs的TEM图像。 A4：Au@PB@Au@AgNPs的TEM图像。 B：Au@PB@Au@AgNPs的TEM-EDS光谱。 C：Au@PB@Au@AgNPs的元素含量（Au、Ag、Fe、C和N）。 D：AuNPs、Au@PBNPs、Au@PB@AuNPs和Au@PB@Au@AgNPs的UV-vis光谱图。 E：AuNPs、Au@PBNPs、Au@PB@AuNPs和Au@PB@Au@AgNPs的Zeta电位图。

ConA添加量和孵育时间对捕获效率的影响及SERS信号优化：研究了ConA添加量（1-8 mg）和孵育时间（20-120 min）对捕获效率的影响，发现4 mg ConA和60 min孵育时间可获得最佳捕获效率（98.93%）。此外，优化了信号探针中PB、Ag和Au的含量，以及SERS信号探针的最佳条件，包括FeCl₂·4H₂O和K₃[Fe(CN)₆]的浓度、HAuCl₄和AgNO₃的用量等。结果表明，Au@PB@Au@AgNPs在2130 cm⁻¹处表现出最强的SERS信号响应，是之前报道的Au@PBNPs的12倍。

图 4 ConA添加量和孵育时间对捕获效率的影响及SERS信号优化：A：不同ConA添加量与沙门氏菌捕获率的关系图。 B：ConA-Fe₃O₄@AuNPs与沙门氏菌孵育时间的优化。 C：不同ConA-Fe₃O₄@AuNPs添加浓度下重悬液和上清液中的相对细菌负载量。 D：Au@PBNPs、Au@PB@AuNPs、Au@PB@AgNPs和Au@PB@Au@AgNPs的SERS光谱。 E：沙门氏菌适配体浓度的优化。 F：信号探针与沙门氏菌孵育时间的优化。 G：沙门氏菌、捕获探针-沙门氏菌、信号探针-沙门氏菌和捕获探针-沙门氏菌-信号探针夹心复合物的TEM图像。

光热性能评估：评估了Fe₃O₄NPs、Fe₃O₄@AuNPs、AuNPs、Au@PBNPs、Au@PB@AuNPs、Au@PB@Au@AgNPs以及物理混合溶液的光热性能。在17.0 W/cm²的光功率密度下，Au@PB@Au@AgNPs在10分钟内温度超过72.5℃，足以灭活沙门氏菌。此外，光热循环加热曲线显示，复合材料在多次加热和冷却循环后仍表现出优异的光热转换稳定性。

图 5 光热性能评估：A：光照区域示意图。 B：不同光功率下Au@PB@Au@AgNPs的光热加热曲线。 C：不同材料溶液在17W/cm²下的实时光热成像图。 D：不同材料溶液在17W/cm²下的光热加热曲线。 E：夹心结构的光热循环加热曲线。

光热裂解沙门氏菌的效果评估：评估了不同纳米材料在LED灯照射前后的杀菌效果。结果显示，Au@PB@Au@AgNPs和物理混合溶液在照射后表现出显著的杀菌效果，杀菌率超过90%，混合溶液在71℃下杀菌率达到100%。SEM和荧光图像显示，照射后细菌结构被破坏，细胞内容物泄漏，证实了光热裂解的有效性。

图 6 光热裂解沙门氏菌的效果评估：A：未经光照处理的对照组和不同纳米材料对沙门氏菌的灭菌效果。 B：经光照处理后不同纳米材料对沙门氏菌的灭菌效果。 C：不同纳米材料处理前后沙门氏菌菌落的照片。 D1：光照处理前后沙门氏菌的SEM图像。 D2：光照处理前后沙门氏菌的荧光图像。

ATP-BL法检测活沙门氏菌的可行性评估：评估了ATP-BL法在光热裂解后检测活沙门氏菌的可行性。结果表明，活沙门氏菌在LED灯照射后释放的ATP显著增加了BL信号，而死沙门氏菌的BL信号微弱。此外，BL信号强度与活沙门氏菌浓度呈线性关系，LOD为8.56 CFU/mL，证明了ATP-BL法可以有效检测活沙门氏菌。

图 7 ATP-BL法检测活沙门氏菌的可行性评估：A：光照处理前后PBS、捕获探针、信号探针和夹心型生物传感器对沙门氏菌的ATP-BL信号。 B：光照处理前后死、活沙门氏菌（1×10⁹ CFU/mL）的ATP-BL强度。 C：不同浓度（1×10³-1×10⁶ CFU/mL）死、活沙门氏菌的ATP-BL强度。 D：不同浓度活沙门氏菌的SERS信号。 E：不同浓度死沙门氏菌的SERS信号。 F：不同比例活沙门氏菌混合样品的SERS信号。

SERS法检测总沙门氏菌的可行性评估：评估了SERS法在检测不同活性状态沙门氏菌的可行性。结果表明，SERS信号强度与总沙门氏菌浓度呈线性关系，LOD为4.99 CFU/mL。此外，SERS法对活菌和死菌均具有良好的信号响应，证明了SERS法可以用于定量检测总细菌数。

图 8 双模传感器在PBS中的检测性能：A：不同浓度混合沙门氏菌样品的拉曼光谱。 B：不同浓度混合沙门氏菌样品的拉曼信号强度与浓度的线性关系图。 C：混合样品中活沙门氏菌的ATP-BL信号强度与浓度的关系图。 D：ATP-BL法在1.18×10¹-1.18×10⁴ CFU/mL浓度范围内的线性关系图。 E：ATP-BL法在1.18×10⁴-1.18×10⁷ CFU/mL浓度范围内的线性关系图。 F：SERS和ATP-BL特异性检测结果（10⁷ CFU/mL的大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、10⁴ CFU/mL的活沙门氏菌及其混合溶液）。 G：SERS法批内和批间重复性结果。 H：SERS法在4℃下的稳定性结果。 I：ATP-BL特异性检测结果。 J：ATP-BL法批内和批间重复性结果。 K：ATP-BL法在4℃下的稳定性结果。

3.总结

本文提出了一种创新的双模态生物传感器，通过整合表面增强拉曼光谱（SERS）和三磷酸腺苷-生物发光（ATP-BL）技术，实现了食品样品中鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）的高效捕获、光热灭活以及活菌和死菌的同步敏感检测。该传感器利用ConA-Fe₃O₄@Au捕获探针和Apt-Au@PB@Au@AgNPs信号探针，形成可磁分离的夹心复合物，产生高强度的SERS信号以定量总菌数，并通过光热裂解触发ATP释放，实现活菌的BL信号响应。通过双信号的自校准，该传感器在2.5小时内完成检测，具有高灵敏度（活菌检测限为8.56 CFU/mL，总菌检测限为4.99 CFU/mL）、高特异性以及出色的光热灭活性能（100%）。此外，该传感器在金银花样品中的回收率为93.73%-106.07%（活菌）和95.68%-106.01%（总菌），展示了其在实际样品检测中的高准确性和可靠性。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.168309