蛋白酶作为一类能水解蛋白质肽键的酶，广泛参与食品加工、消化、疾病诊断等关键过程，其活性受pH影响显著，不同蛋白酶需在酸性、中性或碱性条件下发挥最优作用。传统蛋白酶活性检测方法（如福林法、偶氮酪蛋白法）存在操作繁琐、耗时久、抗干扰能力弱等缺陷，难以满足复杂食品样品的快速检测需求。​

荧光传感器因便捷灵敏的优势成为研究热点，但单一荧光信号易受光漂白、浓度等因素干扰，定量准确性受限；比率荧光虽能克服此问题，却面临双荧光团偶联复杂、光谱重叠等挑战。金纳米簇（AuNCs）具备超小尺寸、大斯托克斯位移等特性，蛋白包裹型AuNCs在传感领域潜力大，然而传统制备方法耗时久、需额外还原剂且成本高。​

微波辅助合成可加速反应，酪蛋白因耐高温（变性温度140℃）、易水解、富含酪氨酸（可还原Au³⁺）且能形成胶束稳定AuNCs，成为理想原料。基于此，本文开发微波辅助合成casein-AuNCs并结合FITC的比率荧光传感器，旨在实现食品中多种蛋白酶的高效、灵敏检测。

图1. 基于FITC-酪蛋白-AuNCS的蛋白酶活性荧光生物传感器的合成路线及工作原理

研究内容

图2. 酪蛋白AuNC的表征

通过700W微波照射30秒，以酪蛋白为还原剂和稳定剂合成casein-AuNCs。其在330nm激发下，640nm处有强红色发射峰，斯托克斯位移达310nm；UV-Vis光谱显示280nm处酪蛋白特征峰，无520nm金纳米颗粒特征峰，证明AuNCs成功合成。TEM观察到AuNCs均匀分布，平均直径4.79nm，晶格间距0.24nm；XRD仅出现{111}晶面衍射峰，表明纳米晶定向生长。FT-IR显示酪蛋白酪氨酸残基特征峰偏移，证实其与AuNCs相互作用。4℃储存1个月后，荧光强度基本不变，说明稳定性优异，为后续传感奠定基础。

图3. 酪蛋白-AuNC的合成与表征

将FITC与casein-AuNCs共价偶联，形成比率荧光探针。在不同pH缓冲液（碱性pH10.5、中性pH7.5、酸性pH3.0）中透析后，探针在520nm（FITC）和640nm（AuNCs）处均有荧光峰。UV-Vis光谱新增500nmFITC特征峰，证实偶联成功。DLS显示碱性条件下探针粒径（191.4nm）大于中性和酸性，因碱性环境增强酪蛋白负电荷排斥，使胶束结构松散。XPS分析发现Au(0)/Au(I)比例在pH10.5和7.5时为1.38，pH3.0时为1.21，Au(I)有助于稳定AuNCs，且不同pH下探针结构稳定，满足多类型蛋白酶检测需求。

图4. FITC-酪蛋白-AuNCs检测蛋白酶活性的机制

蛋白酶水解酪蛋白模板是检测核心机制。当蛋白酶存在时，其水解酪蛋白使casein-AuNCs失去稳定，发生聚集导致640nm处荧光衰减；同时，酪蛋白水解释放FITC标记短肽，恢复FITC固有荧光，使520nm处荧光增强。通过测定F₅₂₀/F₆₄₀比值实现定量检测。厌氧实验表明，溶解氧不影响AuNCs荧光衰减，排除氧淬灭干扰；DLS和TEM观察到水解后探针粒径减小且出现AuNCs聚集体，ICP-MS检测到Au释放量随酶活性增加而升高（1.1-5.7mg/L），进一步证实水解引发AuNCs聚集的机制。

图5. FITC-酪蛋白-AuNC的稳定性

优化检测条件（200μL反应体系、40℃孵育、10mg/mL酪蛋白浓度、0.5h孵育时间）后，探针对碱性、中性、酸性蛋白酶的检测线性范围均为0.5-15U/mL（R²分别为0.9945、0.9963、0.9982），检测限分别低至0.29、0.36、0.49U/mL，优于现有多数传感平台。对实际样品（人体唾液、芒果汁、无花果汁、发酵剂）进行加标回收实验，回收率96.68%-103.51%，RSD≤4%，且与标准方法结果一致，证实该传感器在食品蛋白酶检测中的实用性与准确性，单样品检测成本仅约0.5美元。

 本研究通过家用微波炉30秒快速合成casein-AuNCs，偶联FITC构建比率荧光传感器，实现食品中三类蛋白酶的高灵敏检测。该传感器借助蛋白酶水解引发的AuNCs聚集荧光衰减与FITC荧光恢复，通过F₅₂₀/F₆₄₀比值定量酶活性，检测限低、抗干扰能力强，在高温、高盐环境下稳定性优异。实际样品检测回收率理想，成本低廉。此方法不仅解决传统蛋白酶检测的缺陷，还为食品领域其他酶活性检测提供新思路，未来有望拓展至生物分析、催化、药物递送等多个领域，具有广阔应用前景。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.143078