诺如病毒是高度传染性的胃肠道病毒，主要通过粪-口途径传播，可引发急性胃肠炎，导致腹泻等症状，是重要的食源性致病菌，全球范围内频发疫情，造成重大经济损失和公共卫生挑战。作为RNA病毒，其易变异特性降低了疫苗效力，因此快速精准检测对防控其传播至关重要。​

现有检测方法存在局限：RT-PCR虽灵敏准确，但依赖专业设备和复杂操作；ELISA操作简单但灵敏度低、样品制备要求高；病毒培养耗时且需专业技能。CRISPR-Cas技术在核酸检测中潜力巨大，结合荧光等技术应用广泛。纳米材料因独特理化性质助力生物分析发展，DNA水凝胶在生物传感中前景良好，但多数传感器为单一模式，影响定量准确性。基于此，本研究构建多模式传感系统，实现诺如病毒高灵敏准确检测。

研究内容

图1.基于DNA水凝胶打捞策略的三合一平台示意图。

该平台包含三部分：GCSNAs探针合成、含GCSNAs的DNA水凝胶制备、靶标引发的凝胶降解与探针释放。GCSNAs通过Au-PolyA亲和作用制备，含AuNPs核心、内部纳米间隙（嵌入PATP作为拉曼报告分子）及表面ssDNA-FAM，具备三重信号。DNA水凝胶由两种部分互补的环状DNA经RCA生成的长链DNA杂交纠缠形成，嵌入GCSNAs呈酒红色。当诺如病毒存在时，其RNA经RT-RPA扩增为dsDNA，激活CRISPR-Cas12a的ssDNA切割活性，降解水凝胶释放GCSNAs，实现荧光、比色、拉曼三重检测，满足不同场景需求。

图2.三合一探针的合成与表征。

通过分步反应制备GCSNAs，溶液颜色从酒红变为深红。TEM显示AuNPs粒径14nm，GCSNAs粒径42nm，分散均匀且含内部纳米间隙。UV吸收峰从AuNPs的521nm依次红移至SNA的527nm、GCNP的542nm、GCSNAs的549nm，DLS显示粒径从24nm增至78nm，均证明颗粒尺寸随反应增大。Zeta电位表明GCSNAs在高盐溶液中仍稳定。拉曼光谱在1074cm⁻¹处出现PATP特征峰，COMSOL模拟显示Au核壳结构间隙电场强度是AuNPs的1.7倍，增强拉曼信号，证实GCSNAs制备成功且性能优异。

图3.表面等离子体模拟。

通过分步反应制备GCSNAs，溶液颜色从酒红变为深红。TEM显示AuNPs粒径14nm，GCSNAs粒径42nm，分散均匀且含内部纳米间隙。UV吸收峰从AuNPs的521nm依次红移至SNA的527nm、GCNP的542nm、GCSNAs的549nm，DLS显示粒径从24nm增至78nm，均证明颗粒尺寸随反应增大。Zeta电位表明GCSNAs在高盐溶液中仍稳定。拉曼光谱在1074cm⁻¹处出现PATP特征峰，COMSOL模拟显示Au核壳结构间隙电场强度是AuNPs的1.7倍，增强拉曼信号，证实GCSNAs制备成功且性能优异。

图4.纯DNA水凝胶和DNA水凝胶/GCSNA复合物的表征。

两种环状DNA经RCA生成的长链DNA杂交纠缠形成纯DNA水凝胶，嵌入GCSNAs后呈红色，证实水凝胶对GCSNAs的捕获能力。环境SEM显示复合水凝胶表面因颗粒存在更粗糙；干燥SEM显示两者均为花状微结构，但复合组单元尺寸更大；冷冻干燥SEM表明均形成3D网络结构，复合组细胞更大、腔壁更厚、孔隙中细丝更多，可能与GCSNAs在RCA过程中产生的张力有关。拉曼光谱证实复合水凝胶含GCSNAs的特征峰，且平台在4℃储存时信号稳定，表明其结构稳定。

图5.检测曲线

优化RT-RPA条件及GCNP合成用金分子生长液体积（80μL最优）。荧光模式下，FAM荧光强度随诺如病毒RNA浓度升高而增强，在0.01–1000pM范围内与浓度对数呈线性（R²=0.9966），检测限0.5fM。比色模式通过智能手机“ColourGrab”分析，R/RGB比值在0.001–100pM范围内与浓度对数线性相关（R²=0.99607），检测限83aM。SERS模式中1074cm⁻¹处峰强在0.001–1000pM范围内与浓度对数线性相关（R²=0.9891），检测限0.16fM。三种模式中比色法检测限最低，SERS法线性范围最宽，整体灵敏度优于多数现有方法。

图6.特异性试验

特异性实验中，非特异性随机RNA的信号强度远低于诺如病毒特异性序列，混合样品信号与同浓度靶标无显著差异（P<0.05），表明平台特异性良好。对草莓和牡蛎样品加标检测，荧光法回收率91.81-117.17%，RSD1.33-5.93%；比色法回收率96.60-101.21%，RSD0.49-4.97%；SERS法回收率93.72-107.08%，RSD1.31-5.23%，准确性和精密度良好。与其他等温扩增方法相比，RT-RPA的39℃最优温度更适合现场检测，结合CRISPR确保特异性，多模式验证提升结果可靠性，降低假阳性/阴性概率。

本研究构建的三合一生物传感器，借助GCSNAs探针的三重信号及DNA水凝胶、RT-RPA、CRISPR-Cas12a的协同作用，实现诺如病毒高灵敏检测，三种模式检测限低至0.16fM，线性范围宽。平台特异性强，实际样品加标回收率理想，多模式验证提升准确性。该方法无需复杂生物功能化控制，利于商业化；分离靶标识别与信号输出可减少基质干扰，可通过更换序列拓展至其他病毒及非核酸分子检测。简化操作、降低成本和人员要求，在环境分析、医疗诊断、食品安全等领域应用前景广阔，为多模式分析和多功能传感平台发展开辟新途径。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.136523