金黄色葡萄球菌（S. aureus）是常见的食源性致病菌，尤其易污染海产品，可引发食物中毒，导致呕吐、腹泻等症状，严重时危及生命。各国对食品中S. aureus含量有严格限制，因此快速、灵敏检测至关重要。

现有检测方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、表面增强拉曼光谱（SERS）等存在灵敏度不足、操作复杂或依赖昂贵设备等问题。电化学发光（ECL）生物传感器因灵敏度高、响应快受关注，但多数需共反应物（如TPrA、H₂O₂），易导致检测体系不稳定、结果偏差。

金纳米簇（AuNCs）作为发光体有潜力，但发光效率低且需共反应物。通过配体刚性化构建主客体结构可提升其性能。同时，单一信号放大策略灵敏度有限，DNAwalker与HCR结合的双放大策略可增强信号。基于此，本文开发无共反应物ECL传感器，以解决S. aureus高灵敏检测难题。

研究内容

图1.生物传感器与ECL机构的装配过程

传感器组装流程为：电极修饰Zn/Co-MOF，固定H1并封闭非特异性位点；S. aureus与适配体结合释放cDNA，cDNA打开H1，在ExoIII作用下引发DNA walker循环，产生的片段触发H2-AuNCs与H3的HCR，形成长链DNA，富集更多Arg/ATT-AuNCs。

ECL机理为：Arg/ATT-AuNCs氧化生成阳离子自由基，HEPES氧化后去质子化形成自由基，两者反应生成激发态Arg/ATT-AuNCs，其返回基态发出光信号，无需共反应物。主客体结构通过氢键抑制配体振动，减少非辐射跃迁，提升发光效率。

图2.Arg/at-auncs的表征

TEM显示Arg/ATT-AuNCs为亚圆形单分散，尺寸均匀。XPS全谱含C、Au、N等元素，S2p谱证实Au-S键存在。FT-IR中3100-3500cm⁻¹处NH键振动峰证明Arg结合。UV-vis光谱有220-300nm特征峰，荧光光谱显示其荧光强度显著高于ATT-AuNCs，UV灯下绿光更强，ECL信号也更高，表明其成功合成且发光性能优异。

图3.Zn/Co-MOF的表征

SEM显示Zn/Co-MOF为规则十二面体结构，对称性高，提供丰富DNA结合位点。元素mapping和EDS证实Co、Zn元素均匀分布，表明合成成功。不同批次SEM显示结构一致，同批次修饰电极的CV曲线误差小，同一电极连续扫描20段redox曲线稳定，证明其重现性和稳定性良好，适合作为DNAwalker的轨道。

图4.生物传感器的ECL曲线和凝胶电泳

ECL曲线验证了组装过程：无Arg/ATT-AuNCs时无信号，加入后产生信号。双放大策略（DNA walker + HCR）的ECL强度是无放大组的4.5倍，证明其有效性。

凝胶电泳显示：适配体与cDNA形成双链（lane3），S. aureus结合适配体使双链解离（lane4）；ExoIII切割H1释放walker（lane6）；HCR生成聚合物（laned），证实传感器设计可行。

图5.生物传感器的电化学表征

CV和EIS表征组装过程：Zn/Co-MOF修饰电极电流降低（导电性差）；固定H1后电流升高（改善电荷传递）；BSA和cDNA修饰使电流降低、Rct增大（非导电性）；ExoIII作用后电流升高、Rct减小（移除非导电链）；HCR后电流降低、Rct增大（DNA聚合物阻碍电子传递），均证明传感器组装成功。

图6.实验参数的改进

优化参数包括：检测pH为8.5（平衡ExoIII活性与AuNCs稳定性）；HCR反应时间60min（确保充分反应）；H2和H3浓度2μM（避免过量阻碍电子传递）；适配体浓度150nM（提供足够结合位点）；ExoIII孵育时间40min、浓度2U（高效剪切且不影响体系稳定）。这些参数使传感器性能最优。

图7.ECL生物传感器的性能分析

最优条件下，S. aureus浓度与ECL强度正相关，线性范围1.00×10¹-1.00×10⁹CFU/mL，R²=0.994，检测限1.16CFU/mL（S/N=3）。与其他方法相比，该传感器线性范围更广、检测限更低，优于需共反应物的ECL传感器及ELISA、SERS等方法，体现其高灵敏度。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.160268