多功能生物传感器：基于 RNA G - 四链体水解检测阿尔茨海默病细胞及酸性食品中的 Zn²⁺和 Cu²⁺

引言

锌（Zn²⁺）与铜（Cu²⁺）是人体必需微量元素，却也具潜在污染性。细胞内，二者分别参与金属蛋白酶活性调节、呼吸及抗氧化反应，但其失衡与阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病相关，会加剧神经毒性。环境中，它们源于采矿、电镀等工业活动及农业施肥，工业废水浓度超安全阈值，危害生态且经食物链影响健康。传统检测方法繁琐，现有生物传感器多针对单一离子，还存在细胞毒性高、灵敏度低等问题。而 RNA G - 四链体（G4）二级结构独特，溶酶体 RNase T2 可水解 RNA 且活性受 Zn²⁺、Cu²⁺抑制，据此需开发能同时检测两种离子的荧光生物传感器，以满足疾病研究与食品安全检测需求。

本研究开发双功能荧光生物传感器，利用 Zn²⁺、Cu²⁺对 RNase T2 活性的抑制作用（方案 1），可同步监测活细胞与体外环境中二者水平。为实现该目标，先合成花菁染料探针 SCY-5，其能在溶酶体中高亲和力选择性结合 RNA G-四链体（G4）；再将 SCY-5 与人工合成的外源性 RNA G4 结合，助力其在活细胞内高效递送至溶酶体。进入溶酶体后，RNase T2 水解 RNA G4，释放 SCY-5 导致荧光猝灭；而 Zn²⁺、Cu²⁺浓度升高会抑制 RNase T2 活性，阻碍 RNA G4 降解使其积累，进而增强 SCY-5 荧光。该传感器可检测酸性食品中 Zn²⁺、Cu²⁺残留，还能追踪活细胞内随阿尔茨海默病进展的溶酶体 Zn²⁺、Cu²⁺波动。因 G4 在细胞内稳定，SCY-5 对 G4 构象特异性、灵敏度高，传感器在细胞环境与食品基质中稳定性良好。

方案 1. 用于监测阿尔茨海默病进展和酸性食品中 Zn ²⁺ 和 Cu ²⁺ 水平的多功能生物传感器的示意图。

2. 结果与讨论

SCY-5 特异性识别 RNA G4s：SCY-5 在含 K⁺缓冲液中形成 J 聚集体，与 RNA G4 结合后解离为单体，荧光增强，对 RNA G4 特异性高，结合快且复合物光稳定，其他核酸无此效果。

图 1. (A) 不同条件下 SCY-5 聚集体转化的示意图。(B) 加入 R-TRF2 G4s 后 SCY-5（2 μM）的吸收光谱。(C) 各种 DNA 模型（5 μM）引起的 SCY-5（1 μM）最大吸收波长红移（∆λ）。(D) 加入 R-TRF2 G4s 后 SCY-5（2 μM）的荧光光谱。(E) 在 1:5 摩尔比下，各种核酸模型存在时 SCY-5 在 590 nm 处的荧光强度比（F/F₀）。(F) 在不同温度下，加入（0、5 和 10 μM）SCY-5 时测量的 R-TRF2 G4s（5 μM）在 260 nm 处的摩尔旋光度。(G) 加入 G4s 后的时间依赖性荧光强度（590 nm）。所有样品均在 20 mM Tris-HCl 缓冲液（含 150 mM KCl，pH 7.2）中制备。

体外 Zn ²⁺ 和 Cu ²⁺ 测量：传感器组成为 1μM SCY-5、1μM R-TRF2 G4 及 0.2mg/mL RNase T2，pH4.0、37℃时最优，对 Zn²⁺、Cu²⁺检测限低，加螯合剂可特异性区分二者。

图 2. (A) SCY-5-G4（1 μM）在不同 RNase T2 浓度（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 和 1 mg/mL）下的圆二色谱（CD）和荧光光谱，于添加后 1 小时测量。(B) SCY-5-G4（1 μM）添加 RNase T2 后的归一化 CD 和荧光强度。(C) SCY-5-G4（1 μM）在添加 RNase T2 后的归一化 CD 和荧光强度随时间变化。(D) SCY-5-G4（1 μM）在存在 RNase T2（0.2 mg/mL）条件下的归一化 CD 和荧光强度随时间变化。(E) SCY-5-G4 的荧光光谱，在存在 RNase T2（0.2 mg/mL）且无（100 μM）Zn 2+ 和 Cu 2+ ，以及存在（100 μM）Zn 2+ 和 Cu 2+ 时的变化。(F) SCY-5-G4（1 μM）在存在 RNase T2（0.2 mg/mL）条件下对 Zn 2+ 的响应荧光光谱。(G) SCY-5-G4（1 μM）在存在 RNase T2（0.2 mg/mL）条件下对 Cu 2+ 的响应荧光光谱。(H) SCY-5-G4（1 μM）在存在 RNase T2（0.2 mg/mL）和不同金属（1 mM）条件下，在存在 Cys 或 TPEN 时的荧光强度。所有样品均制备于 20 mM Tris-HCl 缓冲液，含 150 mM KCl，pH 4.0。

SCY-5 和 RNA G4s 在活细胞中的定位：SCY-5 对活细胞几乎无毒，与 RNA G4 及二者复合物均精准靶向溶酶体，4 小时可完全进入，与线粒体共定位率低。

图 3. 荧光显微镜下标记了 Cy5-R-T-RF2（Cy5-G4）（1 μM）、SCY-5（1 μM）和 SCY-5-G4 复合物（1 μM）的 SH-SY5Y 细胞图像。溶酶体用 LysoTracker™ Green DND-26（LTG，50 nM）染色，线粒体用 MitoTracker Green（MTG，50 nM）染色。比例尺，10 μm。

活细胞中 Zn 2+ 和 Cu 2+ 的监测：外源加 Zn²⁺/Cu²⁺或用 H₂O₂/PDTC 诱导内源性离子释放，传感器荧光增强；加对应螯合剂荧光减弱，可监测活细胞溶酶体中离子波动。

图 4. 使用共聚焦显微镜检测在 SCY-5-G4（1 μM）处理 4 小时的不同条件下 SH-SY5Y 细胞中的 Zn2+。(A)用外源性 ZnSO4（0, 10, 20 μM）和 Cys（50 μM）处理 2 小时。(B)用外源性 ZnSO4（50 μM）、TPEN（0, 0.5, 1 mM）和 Cys（50 μM）处理 2 小时。(C)用外源性 H2O2（0,1, 2 mM）和 Cys（50 μM）处理 2 小时。(D)用外源性 H2O2（1 mM）、TPEN（0, 0.5, 1 mM）和 Cys（50 μM）处理 2 小时。直方图显示 SCY-5-G4 的相对荧光强度（R.F.I.）。每个样本测量约 300 个细胞。标尺，10 μm。数据表示为均值±标准差。n.s.：无显著差异，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，和****P < 0.0001 由 Student's t 检验确定。

图 5. 使用共聚焦显微镜检测在不同条件下用 SCY-5-G4（1 μM）处理 4 小时的 SH-SY5Y 细胞中的 Cu2+。(A)用外源 CuSO4（0, 10, 20 μM）和 TPEN（50 μM）处理 2 小时。(B)在培养液中用外源 CuSO4（50 μM）、Cys（0, 0.5, 1 mM）和 TPEN（50 μM）处理 2 小时。(C)用 PDTC（0, 1, 2 mM）和 TPEN（50 μM）处理 2 小时。(D)用 PDTC（1 mM）、Cys（0, 0.5, 1 mM）和 TPEN（50 μM）处理 2 小时。直方图显示 SCY-5-G4 的 R.F.I.。每个样本测量约 300 个细胞。标尺，10 μm。数据表示为均值±标准差。n.s.：无显著差异，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，和****P < 0.0001 由 Student's t 检验确定。

监测阿尔茨海默病发展过程中的 Zn ²⁺ 和 Cu ²⁺：Aβ1-42 诱导 AD 细胞模型，Aβ 浓度越高，传感器荧光越强（离子水平越高）；加姜黄素缓解 AD，荧光减弱，证实离子水平与 AD 进展相关。

图 6. 在不同条件下使用 SCY-5-G4（1 μM）处理 SH-SY5Y 细胞 4 小时后的共聚焦成像：(A) 在培养基中添加 Aβ1-42（0, 5 和 10 μM）处理 24 小时，然后加入 Cys（50 μM）继续孵育 2 小时。(B) 在培养基中添加 Aβ1-42（0, 5 和 10 μM）处理 24 小时，然后加入 TPEN（50 μM）继续孵育 2 小时。(C) 在培养基中添加 Aβ1-42（10 μM）处理 24 小时，然后加入 CUR（0, 10 和 20 μM）和 Cys（50 μM）继续孵育 2 小时。(D) 在培养基中添加 Aβ1-42（10 μM）处理 24 小时，然后加入 CUR（0, 10 和 20 μM）和 TPEN（50 μM）继续孵育 2 小时。直方图显示 SCY-5-G4 的 R.F.I.，每个样本测量约 300 个细胞。标尺，10 μm。数据表示为均值±标准差。n.s.：无显著差异，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，和****P < 0.0001 由 Student's t 检验确定。

检测真实酸性食物中的 Zn ²⁺ 和 Cu ²⁺：对多种酸性食品加标检测，回收率 91.5%-109%，RSD<5.3%，结果与原子吸收光谱法一致，可准确检测食品中两种离子。

图 7. biosensor 检测酸性食物中 Zn 2+ 和 Cu 2+ 的示意图。

3. 总结

本研究开发的基于 RNA G - 四链体水解的多功能生物传感器，通过 SCY-5 与 RNA G4 的特异性结合、RNase T2 酶活性调控，实现了 Zn²⁺和 Cu²⁺的高灵敏、高特异性同步检测。该传感器兼具两大核心功能：一是实时监测阿尔茨海默病细胞溶酶体中 Zn²⁺、Cu²⁺波动，揭示离子水平与 AD 进展的关联，为 AD 病理研究与治疗监测提供工具；二是精准检测酸性食品中两种金属离子含量，回收率与传统方法一致性高，满足食品安全检测需求。未来可通过优化 SCY-5 荧光量子产率、修饰 RNA G4 序列提升活性位点暴露率，进一步拓展检测离子种类；结合便携式荧光设备，有望实现现场快速检测，在环境监测、临床诊断等领域具有广泛应用潜力。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2025.137847